干扰素γ诱导蛋白10对肝癌肿瘤微环境的影响研究
发布时间：2020-05-27 23:40
【摘要】：目的:构建过表达IP10的肝癌细胞株及过表达IP10的人脐静脉内皮细胞株,研究IP10对肝癌细胞行为学的影响及对肿瘤微环境的影响,并在小鼠体内实验中进一步验证IP10对肝癌的影响。方法:(1)采用慢病毒转染的方法,将过表达IP10的慢病毒及空载慢病毒分别转染肝癌细胞株SK-hep1及人脐静脉内皮细胞株HUVEC,嘌呤霉素进行筛选以获得稳定表达IP10的细胞株。(2)采用实时荧光定量PCR以验证IP10在转录水平上的表达,Western-blot法检测其在翻译水平上的表达,ELISA检测细胞培养上清中IP10的浓度。(3)采用CCK8检测IP10对肝癌细胞株SK-hep1增殖的影响,粘附性实验检测IP10对肝癌细胞株SK-hep1同质粘附及异质粘附的影响,Transwell法检测IP10对肝癌细胞株SK-hep1迁移、侵袭的影响。(4)采用CCK8检测IP10对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖的影响,流式法检测IP10对人脐静脉内皮细胞HUVEC周期的影响,Transwell法检测过表达IP10的肝癌细胞培养上清对T淋巴细胞的趋化作用。(5)构建小鼠皮下肝癌模型,到肿瘤生长达到约8mm时,瘤内分别注射PBS、空载慢病毒、过表达IP10慢病毒。观察肿瘤体积变化,及采用免疫组织化学法检测IP10、血小板-内皮细胞粘附分子CD31、M1型巨噬细胞中的特异性表面抗原CD86、T细胞表面标志物CD3的表达情况并采用流式检测法进一步检测肿瘤T淋巴细胞浸润情况。结果:(1)成功构建了稳定表达IP10的肝癌细胞株及人脐静脉内皮细胞株,通过嘌呤霉素筛选后在荧光显微镜下观察,细胞100%带绿色荧光。(2)实时荧光定量PCR及Western-blot检测显示SK-hep1-IP10及HUVEC-IP10细胞株中的IP10在转录水平和蛋白水平均较转染空载慢病毒和野生株高,此外,IP10能分泌到细胞培养基上清中。(3)CCK8检测细胞增殖实验结果显示IP10基因的过表达并不影响肝癌细胞株SK-hep1的增殖,细胞粘附实验显示,过表达IP10的细胞株较转染空载慢病毒的细胞株及野生株的同质粘附能力增强,而异质粘附能力减弱,Transwell检测细胞迁移、侵袭能力,结果显示IP10基因的过表达并不影响肝癌细胞株SK-hep1的迁移及侵袭。(4)CCK8细胞增殖实验结果显示过表达IP10的人脐静脉细胞株HUVEC的增殖能力较转染空载慢病毒的细胞株及野生株的低,即IP10能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖,细胞周期结果显示细胞增长抑制在S期,Transwell检测T淋巴细胞趋化实验结果显示培养SK-hep1-IP10细胞株的细胞上清液对T细胞的趋化较空载组及野生组的多,即IP10可趋化T淋巴细胞的浸润。(5)成功构建小鼠肝癌模型,三组小鼠的肿瘤体积比较发现,注射过表达IP10慢病毒组的小鼠皮下肿瘤体积逐渐减小。免疫组织化学结果显示,注射过表达IP10慢病毒组中,肿瘤组织中的IP10、CD3的表达较其余两组增高,CD31较其余两组降低,而CD86变化不明显,流式检测肿瘤组织中淋巴细胞浸润情况,结果显示注射过表达IP10慢病毒组中CD4~+淋巴细胞及CD8~+的淋巴细胞均较对照组高。结论:(1)IP10是一个分泌蛋白,在SK-hep1-IP10及HUVEC-IP10两株细胞培养上清中均能检测到。(2)IP10可影响肝癌细胞的粘附性,但对肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等作用不明显。(3)IP10可影响肿瘤微环境,在体内实验中促进淋巴细胞的趋化、抑制新生血管的生成。
【图文】：
图 1-1 慢病毒转染细胞系的构建对照慢病毒后 SK-hep1 细胞荧光下图像(×100);B:转染空载对照慢病毒后 SK-100);C:转染过表达慢病毒 LV-IP10 后 SK-hep1 细胞荧光下图像(×100);D:转染后 SK-hep1 细胞白光下图像(×100)。Figuer 1-1 Construction of lentivirus-transfected cell linence image of SK-Hep1 cells transfected with lentivirus LV5 (×100); B: White lells transfected with lentivirus LV5(×100); C: Fluorescence image of SKwith overexpressing lentivirus LV-IP10(×100);D: White light image of SKith overexpressing lentivirus LV-IP10(×100).含浓度为 2.5μg/mL 的嘌呤霉素的完全培养基进行筛选，，显微镜下可见表达绿色荧光蛋白的细胞占总细胞数的明成功构建细胞系。
1-2 1%琼脂糖凝胶检测细胞中提取的总 RNA的总 RNA;2:SK-hep1-LV5 细胞株提取的总 RNAe quality of total RNA was detect by 1% agarose g-Hep1 cell line; 2: RNA extracted fromSK-Hep1-ne.提取的总 RNA 在 1%琼脂糖凝胶中8S、18S、5S。其中 5S 条带亮度最 18S 条带亮度的两倍。琼脂糖凝胶电实验需要。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：
图 1-1 慢病毒转染细胞系的构建对照慢病毒后 SK-hep1 细胞荧光下图像(×100);B:转染空载对照慢病毒后 SK-100);C:转染过表达慢病毒 LV-IP10 后 SK-hep1 细胞荧光下图像(×100);D:转染后 SK-hep1 细胞白光下图像(×100)。Figuer 1-1 Construction of lentivirus-transfected cell linence image of SK-Hep1 cells transfected with lentivirus LV5 (×100); B: White lells transfected with lentivirus LV5(×100); C: Fluorescence image of SKwith overexpressing lentivirus LV-IP10(×100);D: White light image of SKith overexpressing lentivirus LV-IP10(×100).含浓度为 2.5μg/mL 的嘌呤霉素的完全培养基进行筛选，，显微镜下可见表达绿色荧光蛋白的细胞占总细胞数的明成功构建细胞系。
1-2 1%琼脂糖凝胶检测细胞中提取的总 RNA的总 RNA;2:SK-hep1-LV5 细胞株提取的总 RNAe quality of total RNA was detect by 1% agarose g-Hep1 cell line; 2: RNA extracted fromSK-Hep1-ne.提取的总 RNA 在 1%琼脂糖凝胶中8S、18S、5S。其中 5S 条带亮度最 18S 条带亮度的两倍。琼脂糖凝胶电实验需要。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
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4 吴v
本文编号：2684328
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