光棘球海胆油脂提取物促HepG2肝癌细胞凋亡的研究

发布时间：2020-05-28 04:04

【摘要】：我国拥有丰富的海洋资源,因为海洋地域的特殊性,海洋生物中油脂的化学特性、生物功能、结构特性等方面与陆地生物脂类具有明显的不同。但海洋生物中获得天然脂类拥有很强的生理活性,存在很大的研究潜力。我国对海洋生物活性物质的研究已取得很大的进展。现研究表明,海胆拥有很强的生物功能及其药理活性,并在抗肿瘤、调节免疫活性等方面取得初步进展。但海胆油脂的生理学功能这一方面的研究还有很大的空白。光棘球海胆,拉丁名为Strongylocentrotus nudus,民间称之为大连紫海胆。海胆油脂(SUL)通过色谱气质分析脂肪酸的组成发现,海胆油脂中脂肪酸含量丰富,其中含29种脂肪酸,其中对抗肿瘤活性存在潜在价值的PUFAω-3和ω-6各占31.83%和14.66%,具有潜在促其癌细胞凋亡的功能。EPA脂肪酸占比13.33%,DHA脂肪酸占比2.13%,文献中明确提到这两种PUFA存在抗肿瘤效果;在此基础之上,本实验研究SUL协同抑制肿瘤细胞扩增转移五氟尿嘧啶(5-FU)对体外培养人类肝癌组织细胞(HepG2细胞)抗肿瘤活性的影响。采用MTBE法提取SUL,之后通过气相色谱-质谱中检测到的各组分保留时间,以及与脂肪酸标准品对比,最后经过NIST02库检索鉴定,分析得到脂肪酸的组成。以HepG2细胞模型测试SUL抗肿瘤能力,以不同浓度或不同处理时间的SUL作用于hepG2细胞,用MTT法、Hoechst33258对细胞杀伤能力进行检测;通过活性氧(ROS)、总SOD酶活力和MDA含量检测进行抗氧化能力的检测;采用线粒体膜电位检测法和FITC/PI双染色法进行检测,通过荧光倒置显微镜和流式细胞仪进行统计分析,从而断定SUL有促进HepG2细胞抑制和凋亡的作用。MTBE法萃取分离的SUL,经GC-MS分析得到,海胆油脂中饱和脂肪酸占比15.26%,单不饱和脂肪酸所占38.30%,多不饱和脂肪酸占比46.96%。HepG2细胞经SUL诱导后细胞呈多种形态,细胞浆收缩,核糖体、线粒体等细胞器聚集在一起,从而使得体积缩小,结构更加紧密;染色质逐渐聚集成新月状,出现在核膜周边,胞膜不断分离出新的碎片,最终细胞变成多个形状各异的由胞膜包裹的物体。MTT法检测发现2.4 mg/mL,2.7 mg/mL,3.0 mg/mL,3.3 mg/mL浓度的SUL作用HepG2细胞均能抑制细胞增殖的作用。Hoechst33258染色法,对照组染色后发现胞核较大,细胞表面浑圆,光滑,胞核发散出清澈的蓝色荧光,细胞核边缘清楚。随着加入的海胆油脂浓度的增大发生细胞的核破碎、细胞开始泯灭现象、脱壁死亡。且浓度越大此现象明显。对于抗氧化的研究:检测细胞内的活性氧(ROS)、总SOD酶活力值、MDA含量3项指标,经SPSS数据分析发现,延长SUL的浓度或处理时间后发现,O_2~-的含量在增加,大量文献证实活性氧可强化caspase的表达,从而指示肿瘤细胞发生凋亡,因此可以说明活性氧的增加也提高了诱导凋亡的能力。对于凋亡能力的检测:首先选用了JC-1线粒体膜电位检测分析法,延长加入海胆油脂后的培养时间,但不改变SUL浓度形况下发现,细胞样本中出现膜电位下降的细胞在增多,正常膜点位的细胞在减少。应用imagineJ对图片荧光强度进行分析,结果发现荧光强度的比值(红色/绿色)在降低,表明了细胞的凋亡程度在加深;其次应用了FITC/PI双染色检测法,不管是SUL的处理时间不同还是浓度的不同,根据细胞在图像上的投影的趋势,可以看出细胞由正常细胞向早期凋亡迁移,最终到达晚期晚期的行走轨迹,所以可以确定海胆油脂在一步步促其凋亡,随着SUL处理时间和浓度的推移凋亡的程度也在加剧。实验表明,这一发现表明SUL拥有抑制肿瘤细胞的能力;其次在探索抑制细胞途径的道路上,SUL可以使细胞内的活性氧的含量在增加,从而提升了细胞的凋亡能力;最后通过试剂盒检测通过SUL的刺激使得凋亡现象确实存在,从而拥有抑制肝癌细胞的能力。从上述的实验总结来看,海胆油脂为肿瘤的预防或缓解提供一条新的研究方向,因此具备成为一种新型功能性食品的潜质。
【图文】：

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图 3.1 脂肪酸组成 GC-MS 色谱图Fig 3.1 GC-MS spectrum of fatty acids-MS 所得的光谱图 3.1 可知，经数据库比对所检测到的脂肪酸达各组分的所占比值，均列于表 3.1。海胆油脂中三大类脂肪酸包饱和脂肪酸比和多不饱和脂肪酸，其所占的比例分别为 15.26%而 EPA 脂肪酸占比 15.65%，DHA 脂肪酸占比 2.55%，已经证实这瘤效果。其中对抗肿瘤活性存在潜在价值的 PUFA ω-3 和ω-6 各占此前文献中记载着应用氯仿-甲醇法提取紫海胆黄中油脂的记录，质谱对脂肪酸组成进行定性定量分析，对结果进行分析后发现与99]。同时符合多数海洋生物油脂组成的规律，不饱和与多不饱和。表 3.1 海胆油脂脂肪酸组成Table 3.1 GC-MS spectrum of fatty acids脂肪酸脂肪酸占比（%）8.86±0.21

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第三章结果与讨论值法检测名为四甲基偶氮唑盐，这是一种化合物又是一种染料，以从外部得到氢原子，因为胞内的线粒体中含有 SDH，反应，，产物为甲月替，物理性质在水溶液中溶解度很低，此反应可以在活细胞内进行，而死细胞没有这个功能。使甲月替晶体溶解。所以根据这一特性，可以根据荧光活细胞的程度。虽然不能定量分析，可以根据酶标仪所检算，便可以算出肿瘤细胞的活率，因此 MTT 法可以得到从而了解抗肿瘤材料对肿瘤细胞的杀伤能力。
【学位授予单位】：大连工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7;TS218

【参考文献】