不可逆性EGFR-TKIs在非小细胞肺癌中获得性耐药机制的体外研究

发布时间：2020-05-28 03:50

【摘要】：研究背景与目的:表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因的T790M突变是一代EGFR-TKIs最常见的获得性耐药机制,约占60%。为了克服T790M突变所致的耐药,不可逆性EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)应运而生。目前,不可逆性EGFR-TKIs主要包括二代EGFR-TKIs和三代EGFR-TKIs。由于二代EGFR-TKIs在抑制T790M突变时对野生型EGFR作用过强,引发一系列剂量相关毒性,这限制了二代EGFR-TKIs在克服EGFR T790M耐药性突变中的应用。而三代EGFR-TKIs可选择性针对EGFR敏感型突变及T790M突变,而对野生型EGFR无抑制作用。不可逆性EGFR-TKIs可以抑制并且延缓EGFR T790M耐药性突变的发生,越来越多的循证医学证据表明第二、三代EGFR-TKIs一线治疗EGFR突变阳性的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)疗效优越,这给我们带来了更多的一线治疗选择。尽管如此,发生耐药却在所难免。虽然目前已有对第二代、第三代EGFR-TKIs的耐药机制的研究报道,但相比于一代EGFR-TKIs的耐药谱而言,这还远远不足。对新一代EGFR-TKIs获得性耐药机制的研究,对于阐明耐药的分子机制以及指导耐药的后续治疗均具有重要意义。本研究前期选取临床上最常见的三代、二代EGFR-TKIs:AZD9291以及阿法替尼,以EGFR 19外显子缺失的肺腺癌细胞系(HCC827)为亲本细胞,成功建立了AZD9291耐药细胞HCC827/AZDR及阿法替尼耐药细胞HCC827/AR,用来模拟AZD9291及阿法替尼初始治疗以后的耐药;在前期研究的基础上,本研究通过对耐药细胞反复鉴定,证明其耐药性与稳定性;进一步对其EGFR、下游通路、旁路途径进行初步探索,以期发现AZD9291以及阿法替尼潜在的获得性耐药机制,并找到能够克服耐药的解决办法。研究方法:1.耐药细胞的鉴定:MTS法检测EGFR-TKIs对亲本细胞HCC827、HCC827/AZDR细胞以及HCC827/AR细胞的增殖抑制率,计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)以及耐药倍数;通过反复冻融、长期去药观察耐药细胞的稳定性;细胞计数法绘制细胞的生长曲线,计算倍增时间;光学显微镜下观察细胞形态,western-blot法对EMT相关标志物进行验证。2.潜在耐药机制的筛选:通过416-癌症相关基因二代测序(Next-generation sequencing,NGS)对亲本细胞以及耐药细胞的416个癌症相关基因的突变状态及拷贝数变异等进行分析;通过RNA测序对比亲本细胞及耐药细胞的基因表达差异。通过测序技术筛选潜在的耐药相关基因。3.耐药机制的初步验证:通过Western-blot法检测EGFR、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、磷脂酰肌醇-3-羟基酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)信号通路、以及其他酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptors,TKRs)的蛋白表达以及激活情况;使用特异性通路抑制剂阻断可疑的耐药通路,MTS法观察抑制剂对耐药细胞的增殖抑制,并计算两种抑制剂联合时的Chou-Talalay相互作用指数(combination index,CI)。研究结果:1.在AZD9291耐药细胞HCC827/AZDR中:(1)通过对AZD9291耐药株进行鉴定,发现其是一株对AZD9291高水平耐药及稳定的细胞株,其耐药倍数为330倍,并且发生了EMT改变;(2)通过对耐药株EGFR信号通路的探索,我们发现亲本细胞HCC827为EGFR扩增的细胞(17×),而HCC827/AZDR细胞EGFR基因的高拷贝数缺失,EGFR的蛋白表达丢失;(3)在耐药细胞中发现MAPK通路异常激活,未发现MAPK通路上关键成员基因水平的变化,而MAPK通路的一个负性调节因子双特异性磷酸酶6(dual specific phosphatase 6,DUSP6)的m RNA表达水平较亲本细胞而言显著下降;(4)HCC827/AZDR细胞对MAPK通路抑制剂(曲美替尼或SCH772984)不敏感,这是由于MAPK通路被抑制剂阻断后AKT通路发生激活,激活的AKT通路不能被AZD9291阻断,但1μmol/L的AKT通路抑制剂MK-2206或GDC-0068联合1μmol/L的MAPK抑制剂曲美替尼或SCH772984可以阻断AKT通路活化并且在一定程度上抑制HCC827/AZDR细胞的增殖;(5)HCC827/AZDR细胞中大部分耐药相关TKRs表达下降,但AXL的表达及IGF1R通路的调节蛋白IGFBP7的表达显著升高;磷酸化的AXL(Y779)的水平在亲本细胞及耐药细胞中相当;而IGF1R在耐药细胞中明显发生激活。(6)IGF1R抑制剂NVP-AEW541不能抑制HCC827/AZDR的增殖,1μmol/L的NVP-AEW541可以抑制HCC827/AZDR细胞IGF1R的磷酸化,但不能抑制MAPK通路的激活;NVP-AEW541联合曲美替尼可以抑制AKT通路的激活,并且抑制AZD9291耐药细胞的增殖。2.在阿法替尼耐药细胞HCC827/AR中:(1)通过对阿法替尼耐药株进行鉴定,发现其是一株对阿法替尼高水平耐药且稳定的细胞株,其耐药倍数为736倍;(2)我们发现亲本细胞HCC827与HCC827/AR均为EGFR基因扩增的细胞,检测到EGFR基因拷贝数分别为:21.6×与13.2×;EGFR的m RNA表达、EGFR总蛋白以及磷酸化蛋白的水平均较亲本细胞而言有所下降。虽然EGFR表达下降,但仍然处于激活状态,且此激活状态可被阿法替尼抑制。(3)在耐药细胞中发现MAPK通路在阿法替尼存在下持续异常激活,而AKT通路仍然可被0.01μmol/L的阿法替尼抑制;MAPK通路上关键基因KRAS基因拷贝数升高(8×),KRAS表达也较亲本细胞明显升高;(4)HCC827/AR细胞对曲美替尼或SCH772984不敏感,这是由于MAPK通路被抑制剂阻断后磷酸化的AKT水平增高,但激活的AKT通路可被阿法替尼阻断;(5)1μmol/L的曲美替尼或SCH772984可以部分逆转阿法替尼耐药。结论:1.AZD9291耐药细胞HCC827/AZDR的鉴定及耐药机制的研究:(1)AZD9291耐药细胞HCC827/AZDR为对AZD9291高水平耐药且长期稳定的细胞株。(2)在HCC827/AZDR中,EGFR基因高拷贝数丢失及EGFR表达下降而导致的AZD9291靶点的缺失可能是AZD9291耐药主要原因。(3)在丢失了原有驱动基因的情况下,异常活化的MAPK信号通路以及与之交联的AKT通路参与维持AZD9291耐药细胞的增殖存活,MAPK通路抑制剂与AKT通路抑制剂联合应用可作为耐药后续治疗选择之一。(4)耐药细胞中IGF1R作为旁路信号异常激活,并且参与AKT下游通路的调控,但耐药细胞的增殖不完全依赖IGF1R信号通路。MAPK通路抑制剂联合IGF1R通路抑制剂也可作为耐药后续治疗选择。2.阿法替尼耐药细胞HCC827/AR的鉴定及耐药机制的研究(1)阿法替尼耐药细胞HCC827/AR为对阿法替尼高水平耐药且长期稳定的细胞株。(2)在HCC827/AR中,EGFR表达虽然下降,但仍然处于激活状态,其依然调控AKT下游通路,并在耐药细胞的增殖存活中发挥作用(3)在本研究中,KRAS扩增可能是潜在的耐药机制,其可能通过激活MAPK信号通路使其不再受上游EGFR的调控,而使细胞对阿法替尼耐药。MAPK通路抑制剂联合阿法替尼可作为阿法替尼耐药的后续治疗选择。
【图文】：

其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）大约占到 80-85%。在过去十年间，随着对肺癌发生发展过程中分子机制的了解不断深入，，晚期 NSCLC的治疗已从当初传统的病理分型指导下的全身化疗时代，过渡到驱动基因指导下的精准治疗时代。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）是重要的细胞膜表面酪氨酸激酶受体（tyrosine kinase receptors, TKRs），其下游主要有丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路，以及磷脂酰肌醇-3-羟基酶（phosphatidylinositol-3-kinases, PI3K）- 蛋白激酶 B（protein kinaseB, PKB/AKT）信号通路，参与细胞的多种生物学过程，包括细胞的增殖、存活以及侵袭和转移。EGFR 基因突变会使 EGFR 酪氨酸激酶区域发生持续激活，从而导致细胞的增殖、存活失控[1]（图 1-1-a）。EGFR 基因的 19 号外显子的缺失及 21 号外显子 L858R 点突变（Leu858Arg）是 EGFR 最常见的两种敏感型突变。

第 6 页 1-2：吉非替尼、阿法替尼及 AZD9291 分子结构特点示意图。igure 1-2: Structural features of gefitinib, afatinib and AZD9291. 代 EGFR-TKIs 仍然是 EGFR 突变阳性的晚期 NSCLC 患
【学位授予单位】：北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 栗景坤;李习;刘美娜;;基于评价指标的非小细胞肺癌治疗质量影响因素分析[J];中国医院统计;2018年06期

2 黄海欣;李桂生;黄东宁;陈绍俊;;多西他赛联合奥沙利铂治疗33例老年晚期非小细胞肺癌[J];柳州医学;2009年01期

3 金冬春;裴俊烽;张前进;缪炳良;竺科英;;多西他赛联合顺铂治疗晚期非小细胞肺癌效果观察[J];中国乡村医药;2018年23期

4 贺家勇;杨晨晨;徐茜;;微小RNA-221在非小细胞肺癌中的表达及意义[J];中国医药导报;2018年32期

5 吴畴斌;方志明;王炜;郝名浩;;泛素特异性蛋白酶9X在非小细胞肺癌中的表达情况及与患者预后的关系[J];癌症进展;2018年12期

6 黄赛男;姚红艳;;中西医结合治疗非小细胞肺癌的研究进展[J];湖南中医杂志;2017年11期

7 汤丽云;;探讨特罗凯治疗晚期非小细胞肺癌的临床疗效[J];世界最新医学信息文摘;2017年91期

8 李嘉;温本;郑文滔;倪薇薇;;加速超分割放疗与常规放疗治疗非小细胞肺癌的近期疗效比较[J];临床医学工程;2017年12期

9 郭芷汛;刘欢;李艳;李刚;;表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂在治疗非小细胞肺癌方面的研究进展[J];实用医院临床杂志;2018年01期

10 戴春雷;邵冲;单月宏;谢永明;臧蔚;;电视胸腔镜肺叶切除术治疗早期非小细胞肺癌的临床效果分析[J];当代医药论丛;2017年22期

相关会议论文 前10条

1 李天女;丁重阳;;非小细胞肺癌隐匿性淋巴结的危险因素分析[A];中国中西医结合学会医学影像专业委员会第十五次全国学术大会暨上海市中西医结合学会医学影像专业委员会2017年学术年会暨《医学影像新技术的临床应用》国家级继续教育学习班资料汇编[C];2017年

2 陈艳;王熙才;周永春;伍治平;金从国;刘馨;姚乾;胡红艳;徐珑峰;田爱;;人非小细胞肺癌原位动物模型的构建及生物学特性比较研究[A];全国肿瘤流行病学和肿瘤病因学学术会议论文集[C];2015年

3 王明慧;肖汀;;热休克蛋白90β在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[A];全国肿瘤流行病学和肿瘤病因学学术会议论文集[C];2015年

4 江一鸣;杨新妹;俞丹璐;王燕;;非小细胞肺癌循环内皮干细胞的检测及临床意义[A];2014年浙江省内科学学术年会青年医师论坛暨内科常见病规范化诊疗国家级学习班论文汇编[C];2014年

5 王子平;;老年晚期非小细胞肺癌治疗思考[A];第三届中国肿瘤内科大会教育集暨论文集[C];2009年

6 张沂平;;非小细胞肺癌个体化化疗[A];2009年浙江省肿瘤学术年会暨肿瘤诊治新进展学习班论文汇编[C];2009年

7 杜开齐;朱有才;张志豪;邬冬强;肖怀清;王细勇;;EGFR在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[A];2009年浙江省胸心外科学学术年会论文汇编[C];2009年

8 仝战旗;吴整军;郝爱真;;非小细胞肺癌患者长期存活原因剖析[A];中华中医药学会内科第十二次肺系病学术交流大会论文集[C];2006年

9 贾小力;陈岗;;中国人非小细胞肺癌表皮生长因子受体突变的研究[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年

10 张杰;;9345例手术切除非小细胞肺癌病理学回顾性分析[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者 李洁尉　通讯员 朱丹萍;非小细胞肺癌相关药物研究获进展[N];中国科学报;2012年

2 记者 安慧娟;治疗非小细胞肺癌新药盐酸安罗替尼胶囊获批上市[N];中国医药报;2018年

3 本报记者 刘卉;非小细胞肺癌疗法趋精准[N];医药经济报;2016年

4 赵舒;临床三足鼎立成型[N];医药经济报;2016年

5 张原;AURA3研究获得非小细胞肺癌靶向治疗新证据[N];中国医药报;2017年

6 本报记者 许宁生;阿法替尼赛点[N];医药经济报;2017年

7 Simon King 编译 廖联明;今年这些药物聚焦全球目光[N];医药经济报;2017年

8 记者 廖晨霞;非小细胞肺癌特定药纳入医保[N];天津日报;2017年

9 塔娜;非小细胞肺癌患者获靶向药援助[N];健康报;2017年

10 记者 冯卫东;加评估晚期非小细胞肺癌治疗现状[N];科技日报;2014年

相关博士学位论文 前10条

1 张阔;EPO/EPOR自分泌途径对非小细胞肺癌发生发展的作用及分子机制研究[D];西北大学;2018年

2 王含璐;人非小细胞肺癌与艾滋病（HIV-1感染）的靶向治疗手段的筛选、优化及其应用[D];北京协和医学院;2018年

3 佟冰;PD-L1在非小细胞肺癌原发灶及外周血循环肿瘤细胞中的表达与分析[D];北京协和医学院;2018年

4 高琪琪;非小细胞肺癌ALK、ROS1及EGFR基因突变与临床病理特征的相关性研究[D];浙江大学;2018年

5 何龙;乏氧微环境下Wnt/β-catenin通路对非小细胞肺癌肿瘤干细胞的影响及机制研究[D];山东大学;2018年

6 丁宁宁;第一部分 临床IA期非小细胞肺癌淋巴结转移预测因素及清扫方式研究 第二部分 趋化因子受体CCR7、CXCR4、CXCR5、CXCL13在T1期非小细胞肺癌中的表达及意义 第三部分 食管-胃交界癌术后吻合口瘘的防治经验及愈合因素分析[D];北京协和医学院;2018年

7 许晶;不可逆性EGFR-TKIs在非小细胞肺癌中获得性耐药机制的体外研究[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2018年

8 吴晶晶;转录因子ZNF326调控ERCC1表达促进非小细胞肺癌的增殖[D];中国医科大学;2018年

9 肖玉波;8-十六烷基小檗碱抗肺癌作用及其机制研究[D];西南大学;2018年

10 侯沙沙;S100A4在非小细胞肺癌肿瘤生长和肥胖症中的作用及分子机制研究[D];北京交通大学;2018年

相关硕士学位论文 前10条

1 周美玲;A20和DCLK1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义[D];吉首大学;2018年

2 黄子菁;益肺散结方（丸）联合TKI治疗Ⅲa-Ⅳ期EGFR突变型非小细胞肺癌延缓TKI耐药及减轻毒副反应的回顾性研究[D];广州中医药大学;2018年

3 刘宇;旋极针法对非小细胞肺癌含铂方案化疗后血液毒性的临床干预[D];广州中医药大学;2018年

4 梁洪陆;晚期非小细胞肺癌FBW7缺陷在多西紫杉醇耐药中的作用及机制探索[D];济南大学;2018年

5 严旭;区间集粗糙集理论与聚类算法研究[D];青海师范大学;2018年

6 陈剑南;多用户MIMO无线数据和功率传输系统的能量效率最大方案[D];南京邮电大学;2018年

7 李思平;数字助听器中语音增强算法的研究[D];南京邮电大学;2018年

8 程志强;无人机MANET网络密钥管理研究[D];西安电子科技大学;2018年

9 廖雪莲;试析英汉交传中的注意力分配[D];上海外国语大学;2019年

10 冯兴恩;基于立体视觉的区域交通智能车障碍物检测方法研究[D];大连理工大学;2018年

本文编号：2684661