肝肾组织培养微流控芯片的构建及其在肿瘤外泌体器官趋向性研究中的应用

发布时间：2020-05-28 13:00

【摘要】：目的:构建基于微流控芯片的肝肾组织培养技术平台,进而在该平台上研究肿瘤细胞外泌体在肿瘤转移中的作用。材料和方法:本实验采用常规紫外光刻胶技术制备SU-8模板,灌注聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS),获得微流控芯片的膜片,打孔后使用预聚物热固化的方法完成膜片与多孔膜的封接,夹具夹紧备用。本实验所用细胞包括人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)、乳腺癌(Breast cancer,BC)细胞系MDA-MB-231和MCF7,分别使用ECM、L-15、DMEM/F12培养液进行培养。微流控芯片组织培养池底部用1:8的Matrigel(BD公司)包被后接种HUVEC,待细胞生长达到紧密连接,使用分子量为10 k Da的FITC-Dextran评价其渗透性。实验动物选取1~2周龄SD大鼠,麻醉后取大鼠的肝和肾组织,使用徕卡活组织振动切片机VT1200S制备直径5 mm厚度250μm的精密组织切片(Precision-cut Tissue Slices,PTS)本文中包括精密肝切片(Precision-cut Liver Slices,PLS)、精密肾切片(Precision-cut Kidney Slices,PKS),置于微流控芯片组织培养池内培养。采用注射泵驱动微通道内的培养液以0.75μL/min恒定流速对PTS进行灌流培养24 h后将培养的PLS、PKS各分为两组,一组用Hoechst33342、Rh-123和PI联合染色,直接鉴定PTS内的细胞活性;另外一组多聚甲醛固定,OCT包埋,苏木精和伊红染色检查组织结构的完整性,使用Ki67抗体进行免疫荧光染色考察细胞的增殖能力,CXCL12抗体进行免疫荧光染色检测PTS趋化因子分泌功能。采用培养0 h的PTS作为对照组。收集MDA-MB-231和MCF7细胞培养48 h的培养基,采用商品化外泌体提取试剂盒Total Exosome Isolation分别提取两种细胞分泌的外泌体。透射电镜成像观察外泌体形态。蛋白质印迹法(Western Blot,WB)鉴定外泌体蛋白表达,具体检测指标包括CD63、CD81、Hsp70、CXCR4、GAPDH。将PKH67标记的MDA-MB-231外泌体加入PTS培养微流控芯片内,与PTS共孵育30 min、60 min,之后考察外泌体的组织趋向性。动物实验选取2周龄的SD大鼠,鼠尾静脉注射PKH67标记的MDA-MB-231外泌体(10μg),24 h后麻醉大鼠,取肝、肾组织,多聚甲醛固定,OCT包埋,制备冰冻切片,DAPI染色,检查外泌体的组织趋向性。利用ELISA试剂盒分别检测PLS、PKS的CXCL12分泌量。外泌体组织趋向抑制实验选取CXCR4受体拮抗剂AMD3100,使用梯度浓度的AMD3100与MDA-MB-231外泌体孵育过夜,然后将外泌体加入PTS培养微流控芯片通道内与组织培养池内的PTS共孵育,考察外泌体的肝趋向性抑制情况。动物实验选取2周龄SD大鼠,在10μg/100μL荧光标记MDA-MB-231外泌体稀释液体系中,加入AMD3100使其终浓度达2μg/m L后共孵育过夜,鼠尾静脉注射,24 h后麻醉大鼠,取肝和肾组织检查外泌体的组织趋向性。结果:本研究构建的PTS培养微流控芯片从下向上依次为:下层PDMS膜片,蚀刻有微通道;聚碳酸酯膜,布满8μm孔径的微孔;中间层PDMS膜片,有2个组织培养池;顶层PDMS膜片,用于封闭组织培养池;整体使用夹具夹紧备用。将大鼠的肝和肾组织制成直径5 mm、厚度250μm的PTS,在PTS培养微流控芯片的培养池内灌流培养24 h。与体外培养0 h的对照组PTS相比较,Hoechst33342、Rh-123和PI联合染色显示两种PTS内的细胞均保持良好的活性,活性率达90%以上;HE切片显示两种PTS均保持完整的组织结构;Ki67染色结果显示PTS内的细胞保持良好的增殖能力;CXCL12染色结果显示PTS保有趋化因子分泌功能。这部分结果提示基于微流控芯片的PTS培养,至少在24 h内可以维持PTS的细胞活性、组织形态结构、细胞增殖能力和趋化因子分泌功能。进而,我们基于该微流控芯片考察了肿瘤细胞外泌体的组织趋向性。从MDA-MB-231和MCF7细胞培养液中分离获得外泌体,电镜检查结果显示外泌体为标准茶托状双层膜结构,WB结果显示外泌体表达典型的标志物,如CD63、CD81、Hsp70蛋白等。基于微流控芯片的外泌体组织趋向性实验结果显示,与肾组织比较,MDA-MB-231外泌体(p0.001)和MCF7外泌体(p0.01)具有明显的肝趋向性,且高转移细胞MDA-MB-231比低转移细胞MCF7的肝趋向性更强(p0.001)。大鼠体内实验结果显示,MDA-MB-231(p0.0001)和MCF7(p0.0001)外泌体具有明显的肝趋向性,在肾组织几乎找不到这两种细胞的外泌体,而且在肝组织MDA-MB-231外泌体显著多于MCF7外泌体(p0.0001)。CXCR4免疫荧光染色和WB结果均显示两种BC细胞均高表达CXCR4,而且WB结果显示BC细胞外泌体表达CXCR4。此前,我们已经分别利用免疫荧光染色法和ELISA试剂盒法证实了PLS中及其分泌的CXCL12量显著高于PKS。这一结果提示CXCL12/CXCR4生物轴可能在BC细胞外泌体的肝趋向性中发挥一定作用。因此,我们使用梯度浓度的CXCR4受体拮抗剂AMD3100处理MDA-MB-231外泌体后,在微流控芯片上考察了AMD3100对MDA-MB-231外泌体肝趋向的拮抗作用,结果发现随AMD3100浓度升高MDA-MB-231外泌体的肝趋向性显著降低,呈明显剂量依赖(0.5μg/m L,p0.05;1μg/m L,p0.01;2μg/m L,p0.001)。大鼠实验同样证实AMD3100可有效抑制MDA-MB-231外泌体在肝组织的定植灶数量(p0.05)。结论:(1)本研究构建了PTS培养的微流控芯片及其操作方法,基于该芯片的PTS培养24 h内可良好地保持细胞活性、组织结构完整性、细胞增殖能力和趋化因子分泌功能。(2)微流控芯片PTS培养和动物实验结果均证实BC细胞外泌体具有明显的肝趋向性。(3)CXCL12/CXCR4生物轴在BC细胞外泌体的肝趋向性中发挥一定的作用。
【图文】：

图 1 PTS 培养微流控芯片的构建（A）基于微流控芯片的 PTS 培养模式图；（B）基于微流控芯片的 PLS 培养示意图；（C）P制备过程及微流控芯片实物图。基于微流控芯片的 PTS 培养模式图如图 1A 所示，芯片主体部分为四层，下至上分别为：（1）第一层 PDMS 膜片，该层刻蚀有两条微通道，，每个微通道

在下层微通道内灌注培养液，流速为 0.75 μL/min。PLS 完好地保存了肝细胞、管细胞、枯否细胞、星形细胞，以及 ECM。PTS 制备过程及微流控芯片实物图图 1C。2. 微流控芯片培养 PTS 的活性、组织结构、增殖能力、趋化因子分泌功能的检
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730

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本文编号：2685273