抑癌基因Foxo1、PTEN、SHP-1和染色体13q14在小鼠NK细胞淋巴瘤发生中的作用探索

发布时间：2020-05-31 20:06

【摘要】：［目的］结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTL)是常见的侵袭性恶性肿瘤之一,约占我国淋巴瘤的6.02%,但发病原因目前尚未明确。根据肿瘤患者的染色体核型、基因拷贝数和基因表达谱结果显示:部分抑癌基因参与了NK/T细胞淋巴瘤的发生和发展。本研究在前期构建的NKp46-iCre转基因小鼠基础上,探究抑癌基因Foxo1、PTEN、SHP-1及染色体13q14在小鼠NK细胞淋巴瘤的发生过程中是否发挥关键作用。该研究主要分为以下三个部分:第一部分:抑癌基因Foxo1和PTEN在小鼠NK细胞淋巴瘤发生中的作用探索［方法］1.利用NKp46-iCre小鼠与ROSA26-YFP~(loxP/stop/loxP)[ROSA26-YFP(+/+)]小鼠交配,得到NKp46-iCre;ROSA26-YFP(+/-)小鼠,利用流式细胞术检测各组织器官中YFP阳性细胞的百分比及脾脏中各淋巴细胞系中YFP阳性细胞的百分比;2.利用NKp46-iCre小鼠分别与Foxo1~(fl/fl)、PTEN~(fl/fl)小鼠交配,得到NKp46-iCre;Foxo1~(fl/fl)PTEN~(fl/fl)(Foxo1~(△NK)PTEN~(△NK))小鼠,即NK细胞内特异性敲除Foxo1和PTEN的小鼠,连续观察小鼠的生长发育和成瘤情况;利用流式细胞术,检测NK细胞内Foxo1和PTEN双基因缺失后小鼠主要淋巴器官内的NK细胞的比例变化;3.利用B16F10恶性黑色素瘤移植瘤小鼠模型,观察小鼠NK细胞内Foxo1和PTEN双基因缺失后对NK细胞的肿瘤免疫监视功能的影响。［结果］1.与对照组NKp46-iCre;ROSA26-YFP(-/-)小鼠相比,NKp46-iCre;ROSA26-YFP(+/-)小鼠的外周血、淋巴结、骨髓、脾脏中YFP表达的阳性细胞的百分比明显升高[(BL:8.03%±1.64%vs 0.01%±0.008%)、(LN:0.26%±0.03%vs 0.01%±0.001%)、(BM:1.37%±0.003%vs 0.003%±0.001%)(SP:2.59%±0.67%vs 0.029%±0.013%)],(n=5,P0.05);两组小鼠非免疫器官心脏中YFP均无明显表达,差别没有统计学意义(Heart:0.009%±0.007%vs0.023%±0.01%)(n=5,P㧐0.05);流式检测NKp46-iCre;YFP(+/-)小鼠脾脏中NK细胞、T细胞和B细胞的YFP阳性细胞的百分比为81.33%±1.43%、0.19%±0.08%、0.11%±0.009%,NK细胞中YFP阳性细胞的百分比明显高于T细胞和B细胞。2.成功建立了在NK细胞内Foxo1和PTEN双基因同时缺失的小鼠模型,连续观察小鼠46周,与对照组小鼠(Foxo1~(fl/fl)PTEN~(fl/fl))相比,Foxo1~(△NK)PTEN~(△NK)小鼠生长发育未见明显异常,未形成自发性肿瘤;Foxo1~(△NK)PTEN~(△NK)小鼠的外周血、淋巴结、骨髓、脾脏中NK细胞的比例无明显变化(BL:4.76%±0.46%vs4.17%±0.64%)(P㧐0.05,n=8);(LN:0.50%±0.10%vs 0.85%±0.20%)(P㧐0.05,n=8);(BM:1.13%±0.23%vs 1.31%±0.10%)(P㧐0.05,n=8);(SP:4.41%±0.65%vs 3.5%±0.24%)(P㧐0.05,n=8)。3.B16F10恶性黑色素瘤移植瘤小鼠模型建立后,与对照组(Foxo1~(fl/fl)PTEN~(fl/fl))相比,Foxo1~(△NK)PTEN~(△NK)小鼠的生存时间无统计学差异(P㧐0.05,n=13)。［小结］NKp46-iCre介导的YFP报告基因标记小鼠体内的NK细胞具有特异性,抑癌基因Foxo1、PTEN在小鼠NK细胞淋巴瘤发生过程中可能不具备关键作用,同时缺失后对体内NK细胞的肿瘤免疫监视功能影响不大。第二部分:抑癌基因Foxo1和SHP-1在小鼠NK细胞淋巴瘤发生中的作用探索［方法］1.利用NKp46-iCre小鼠分别与Foxo1~(fl/fl)、SHP-1~(fl/fl)小鼠交配,得到NKp46-iCre;Foxo1~(fl/fl)SHP-1~(fl/fl)(Foxo1~(△NK)SHP-1~(△NK))小鼠,即在NK细胞内同时敲除Foxo1和SHP-1的小鼠,观察小鼠的生长发育和成瘤情况。2.利用流式细胞术,检测NK细胞内Foxo1和SHP-1双基因缺失后小鼠主要淋巴器官中NK细胞的比例变化。［结果］1.成功建立了NK细胞内特异性Foxo1和SHP-1双基因缺失小鼠模型,连续观察小鼠42周,与对照组小鼠(Foxo1~(fl/fl)SHP-1~(fl/fl))相比,小鼠生长发育未见明显异常,未形成自发性肿瘤。2.与对照组相比,Foxo1~(ΔNK)SHP-1~(ΔNK)小鼠外周血和淋巴结中NK细胞比例明显降低(BL:6.26%±0.478%vs 4.39%±0.23%)(P㩳0.01,n=3);(LN:0.431%±0.08%vs 0.17%±0.04%)(P㩳0.05,n=3);骨髓中NK细胞比例升高(BM:1%±0.09%vs 2.81%±0.76%)(P㩳0.05,n=3);脾脏和肝脏中淋巴细胞所占比例无统计学差异(SP:1.59%±0.07%vs 2.27%±0.76%)(P㧐0.05,n=3);(8.11%±2.99%vs 8.17%±0.73%)(P㧐0.05,n=3)。［小结］抑癌基因Foxo1和SHP-1在小鼠NK细胞淋巴瘤发生过程中可能不具备关键作用,同时缺失后影响小鼠体内主要器官NK细胞的分布。第三部分:抑癌基因Foxo1和PTEN、染色体13q14在小鼠NK细胞淋巴瘤发生中的作用探索［方法］1.利用NKp46-iCre;Foxo1~(fl/fl)13q14~(fl/fl)小鼠与PTEN小鼠交配,最终得到NKp46-iCre;Foxo1~(fl/fl)13q14~(fl/fl)PTEN~(fl/fl)(Foxo1~(△NK)13q14~(△NK)PTEN~(△NK))小鼠,即NK细胞内特异性敲除Foxo1、13q14和PTEN小鼠,观察小鼠的生长发育和成瘤情况。2.利用流式细胞术,检测NK细胞内Foxo1、13q14和PTEN同时缺失后,小鼠主要淋巴器官内的NK细胞的比例变化。［结果］1.成功建立了在NK细胞内Foxo1、13q14、PTEN缺失小鼠模型,连续观察小鼠42周,与对照组(Foxo1~(fl/fl)13q14~(fl/fl)PTEN~(fl/fl))相比,Foxo1~(△NK)13q14~(△NK)PTEN~(△NK)小鼠生长发育未见明显异常,未形成自发性肿瘤。2.与对照组相比,Foxo1~(△NK)13q14~(△NK)PTEN~(△NK)小鼠的外周血、骨髓、淋巴结、脾脏中NK细胞所占比例无明显变化。(BL:5.23%±0.87%vs 6.98%±2.04%)(P㧐0.05,n=5);(BM:1.21%±0.24%vs 1.49%±0.19%)(P㧐0.05,n=5);(LN:0.51%±0.11%vs 0.66%±0.04%)(P㧐0.05,n=5);(SP:2.51%±0.61%vs 2.76%±0.48%)(P㧐0.05,n=5)［小结］抑癌基因Foxo1、PTEN和染色体13q14在小鼠NK细胞淋巴瘤发生过程中可能不具备关键作用。［结论］Foxo1、PTEN同时缺失后对小鼠体内NK细胞介导的肿瘤免疫监视功能影响不大。抑癌基因Foxo1、PTEN、SHP-1和染色体13q14在小鼠NK细胞淋巴瘤发生过程中可能不具备关键作用。
【图文】：

小鼠,PCR鉴定,策略,骨髓

鼠交配策略和 PCR 鉴定结果（A-C: 繁殖产生 Foxo1△NK、P小鼠; D：NKp46、Foxo1 和 PTEN 的 PCR 结果）eneration and PCR results of NKp46-iCre mice (A-C: Strategy oand Foxo1△NKPTEN△NKmice; D: PCR results for NKp46-iCre td floxed PTEN alleles.)组织细胞中 YFP 表达情况细胞术检测 NKp46-iCre；ROSA26-YFP(+/-)和对6-YFP(-/-)小鼠的外周血、淋巴结、骨髓、脾脏、心脏百分比（图 1-5）。与对照组相比，NKp46-iCre；RO淋巴结、骨髓、脾脏中细胞 YFP 表达的阳性细胞的

外周血,心脏,脾脏,淋巴结

图 1-2 各器官（外周血、淋巴结、骨髓、脾脏和心脏）的 YFP 的表达情况Fig. 1-2 The expression levels of YFP from various organs (blood, periphery lymph node, bonemarrow cell, spleen and heart)
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.1

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