RAB3B受miR-92a下调并促进肝癌细胞的恶性行为

发布时间：2020-05-31 16:54

【摘要】：【目的】肝癌作为世界上最常见的实体肿瘤之一,其死亡的概率仅次于胃癌和食管癌,位居世界第三位。肝癌的发生发展与许多因素有关,但常见的病因主要包括乙型及丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素等。近年来有研究表明,许多基因的表达及活性的改变可能影响肝癌的发生发展,其中就包括微小RNA(microRNA,miRNA)。miRNA是一类非编码的单链小分子RNA,其大小约22nt。miRNA可以在转录后水平或转录水平调控基因的表达,参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等。近期的研究表明,许多miRNA通过调节其靶基因参与肿瘤细胞的调控,间接发挥类似癌基因或是抑癌基因的功能。RAB3B是RAS家族中的一员,是细胞内信号传导的重要参与者。近期有报道称其可能与肿瘤的发展有关。然而,关于RAB3B对肝癌细胞的恶性行为的影响尚不明确。本研究主要探讨RAB3B在肝癌发生发展中的作用及其上下游调控机制,为今后肝癌的分子诊断及治疗研究可能提供一个新的角度。【方法】首先我们利用实时定量PCR技术检测了miR-92a在人正常肝脏细胞和肝癌细胞中的mRNA水平,随后在肝癌细胞QGY-7703和HepG2细胞中,通过过表达或封闭miR-92a,利用集落形成实验、MTT实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测miR-92a对肝癌细胞恶性表型的影响,并用western blot检测了EMT相关分子标志物的表达差异;同时通过生物信息学方法预测出了miR-92a可能的靶基因——RAB3B,并利用荧光报告载体实验验证了miR-92a与RAB3B的直接靶定作用,通过实时定量PCR和western blot技术验证了miR-92a对RAB3B的直接调控作用以及可能存在的调控方式。随后利用RNA干扰技术,结合上述表型实验分析RAB3B过表达后或敲降后细胞表型的变化,研究RAB3B的具体功能。最后,我们将与RAB3B的相互作用蛋白进行了质谱分析,并检测了其对ATP生成的影响。【结果】在前期我们进行实时定量PCR,结果显示miR-92a在肝癌细胞中表达明显上调,而过度表达miR-92a后,可以看出肝癌细胞QGY-7703和HepG2细胞的迁移和侵袭能力明显增强,细胞增殖能力也得到提高,并且使上皮细胞分子标志物E-cadherin表达减少,间皮细胞分子标志物Vimentin表达增加。通过实验进一步证实了miR-92a发挥作用的直接靶基因为RAB3B,并通过深入研究RAB3B的功能后发现,过表达RAB3B表达后细胞迁移和侵袭能力增强,且能够促进EMT过程。实时定量PCR和western blot实验结果表明在肝癌细胞中过表达或是封闭miR-92a可以减少或升高RAB3B的mRNA和蛋白表达水平。进行相互作用蛋白质谱分析后发现RAB3B可能与ATP合成有关,过表达RAB3B可以增加ATP的生成。【结论】RAB3B可能与肝癌的发生发展密切相关,它受miR-92a的调控,并可以促进肝癌细胞的增殖以及迁移和侵袭的能力,且参与到EMT的进程中,同时还可以促进ATP的合成。
【图文】：

-cadherin 蛋白、Vimentin 蛋白和 GAPD抗体的 Blotto 中，，4℃孵育过夜。TBST 洗膜 20min，将膜放入含有 HRP 标孵育 2h，然后用 1×TBST 洗膜 20min。estern LingtningTMChemiluminescence R光盒中，置于暗室曝光，得到的显色条描，分析各组目的条带的亮度值。比较各e PCR 检测肝癌细胞中 miR-92a 的表达情人正常肝脏细胞 LO2 细胞以及肝癌细胞 ，通过 Real-time PCR 方法检测了 miR-9胞中，miR-92a 水平均高于正常肝脏细胞呈现一个高表达的状态。

计算方法为:荧光场中带有绿色荧光的细胞数/明场全部细胞数×100%。结果如图1-2 所示，QGY-7703 的转染效率约为 75%，HepG2 细胞的转染效率为 60%明场 荧光场图 1-2 检测两种肝癌细胞的转染效率1.2.4 实时定量 PCR 方法检测 QGY-7703 和 HepG2 细胞在转染pcDNA3/miR-92a 或 ASO-miR-92a 后 miR-92a 的表达情况在 QGY-7703 细胞中，转入 pcDNA3/miR-92a 相较于 pcDNA3 的 miR-92a表达水平升高了约 9.16 倍，而转染合成 ASO-miR-92a 与对照组相比,miR-92a 的表达水平下降了 24%。在 HepG2 细胞中，转染 pcDNA3/miR-92a 相较于 pcDNA3的 miR-92a 表达水平升高了约 4.30 倍，而转染 ASO-miR-92a 与对照组相比,miR-92a 的表达水平下降了 30%。结果如图 1-3 示。QGY-7703HepG2
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

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本文编号：2690174