人参皂苷Rh2抑制肝癌细胞HepG2的增殖和迁移及机制研究

发布时间：2020-06-03 05:13

【摘要】：目的:探讨人参皂苷Rh2对肝癌细胞HepG2的增殖和迁移的抑制以及其作用机制。为人参皂苷治疗肝癌的临床应用提供理论依据。方法:20 μg/mL人参皂苷Rh2处理肝癌细胞HepG2、Huh7和SMMC7721 48 h后收集细胞,qRT-PCR 检测人参皂苷 Rh2 对 miR-29a-5p、miR-26b-3p、miR-224-3p、miR-200b-5p和miR-146a-5p表达的影响;20 μg/mL人参皂苷Rh2处理肝癌细胞HepG2 1天、3天和5天,MTS法检测人参皂苷Rh2对HepG2细胞增殖的影响。转染 miR-146a-5p minics、miR-146a-5p inhibitor 或者对照(negative control,NC)miRNA,在人参皂苷Rh2处理下,MTS法检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞仪分析细胞凋亡和周期;Westernblot检测细胞中MCL1、MMP2和Nrf2蛋白表达水平。包装 miR-146a-5p 过表达和 miR-146a-5p inhibitor 慢病毒,感染 HepG2 细胞,构建稳定细胞株。通过裸鼠皮下成瘤实验研究人参皂苷Rh2联合过表达miR-146a-5p或抑制miR-146a-5p表达对瘤体生长的影响,Western blot和免疫组化检测组织中MCL 1、MMP 2和Nrf2蛋白的表达。20μg/mL人参皂苷Rh2处理肝癌细胞HepG2 48h后,收集细胞,lncRNA芯片分析人参皂苷Rh2对肝癌细胞lncRNA表达谱的影响。结果:和未经处理的肝癌细胞组相比,人参皂苷Rh2处理组的三种肝癌细胞中miR-29a-5p和miR-26b-3p的相对表达水平均显著降低;而miR-224-3p、miR-200b-5p和miR-146a-5p的相对表达水平均显著增加,其中miR-146a-5p的相对表达水平增加最大,其相对表达水平在肝癌细胞HepG2、Huh7和SMMC7721中相对表达量分别为4.14±0.2、3.12±0.15和3.05±0.02。MTS实验结果显示人参皂苷Rh2能显著抑制HepG2细胞的增殖。人参皂苷Rh2联合过表达miR-146a-5p能够抑制肝癌细胞HepG2的增殖、迁移、侵袭和克隆成形,抑制HepG2细胞由G1期向S期转化,抑制HepG2细胞中MCL1、MMP2和Nrf2的表达。裸鼠体内成瘤实验发现抑制miR-146a-5p的表达能够显著促进瘤体的生长;而人参皂苷Rh2联合过表达miR-146a-5p能够显著抑制瘤体的生长;Western blot和免疫组化结果表明人参皂苷Rh2联合过表达miR-146a-5p对裸鼠体内瘤体组织中蛋白MCL 1、MMP 2和Nrf 2的表达有抑制作用。lncRNA芯片分析人参皂苷Rh2对HepG2细胞lncRNA和mRNA表达的影响,发现差异lncRNA共703个,其中上调的lncRNA为580个,下调的lncRNA为123个;其中差异mRNA共489个,其中上调的mRNA为329个,下调的mRNA为160个。其中差异变化最大的LncRNAXLOC_012708和LncRNA LOC285547很有可能参与人参皂苷Rh2对肝癌细胞的抑制过程。结论:本研究发现人参皂苷Rh2能显著促进肝癌细胞HepG2中miR-146a-5p的表达;发现人参皂苷Rh2作用肝癌细胞HepG2的lncRNA差异表达谱。揭示了人参皂苷Rh2通过miR-146a-5p对肝癌细胞HepG2的增殖、迁移、侵袭和克隆形成产生明显的抑制作用,为防治肝癌转移提供理论依据和潜在的治疗靶点。
【图文】：

收集三种肝癌细胞的各组细胞进行ＲＮＡ抽后，采用１％琼脂糖的凝胶对逡逑ＲＮＡ进行电泳并对提取的细胞总ＲＮＡ纯度进行分析，对ＲＮＡ电泳凝胶成象结逡逑果结果如图２－１所示。２８ｓ邋ｒＲＮＡ、１８ｓ邋ｒＲＮＡ和５ｓ邋ｒＲＮＡ三条带均完整，并且逡逑２８ｓ条带亮度大约是１８ｓ条带亮度的两倍，显示总ＲＮＡ提取比较完整。逡逑１２３４５６７８９逡逑图２－１：邋ＲＮＡ电泳图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１：邋ＲＮＡ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ逡逑１８逡逑

２．２．２人参皂苷Ｒｈ２对肝癌细胞中ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ表达的影卩向逡逑应用ｑＲＴ－ＰＣＲ检测人参皂苷Ｒｈ２对肝癌细胞ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７和ＳＭＭＣ７７２１逡逑中ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ相对表达的影响，其扩增曲线和溶解曲线如图２－２所示。ｑＲＴ－逡逑卩０１检测结果显示，，在肝癌细胞设？０２、１１１１１１７和８＾／＾０７７２１中，与：６１＆１１１＾６１１逡逑组肝癌细胞中ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ相对表达量相比，ＤＭＳＯ处理组肝癌细胞中ｍｉＲ－逡逑２６ｂ－３ｐ相对表达量差异均不显著，不具有统计学意义（Ｐ＞０．０５），人参皂苷逡逑Ｒｈ２处理组三种肝癌细胞中ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ相对表达量均显著降低，在肝癌细胞逡逑ＳＭＭＣ７７２１中降低最显著，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ＤＭＳＯ处理组逡逑相比，人参皂苷Ｒｈ２处理组肝癌细胞中ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ相对表达量均显著降低，差逡逑异具有统计学意义（Ｐ＜0．0５），结果如图２－３所示。逡逑金邋：厂邋｜邋ｉｍａｘ逡逑图２－２：三种肝癌细胞中ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ的扩增和熔解曲线逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２：邋Ｔｈｅ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｃｕｒｖｅ邋ａｎｄ邋ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ邋ｉｎ邋ｔｈｒｅｅ邋ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ逡逑ｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｃｅｌｌ邋ｌｉｎｅｓ逡逑ｍ邋ｉＲ－２６ｂ－３ｐ逡逑１．５邋ｎ逡逑Ｂｌａｎｋ邋ｃｅｌｌ逡逑0逦Ｔ逦■ＤＭＳＯ逡逑ｔａｒ逡逑ＨｅｐＧ２逦Ｈ邋ｕｈ７邋ＳＭＭＣ７７２１逡逑图２－３？．三种肝癌细胞中ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ的相对表达量逡逑１９逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

【参考文献】

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本文编号：2694352