CagA、MACC1、Th17细胞与胃癌发生发展的相关性研究

发布时间：2020-06-03 00:53

【摘要】：目的:胃癌发病因素很多,本课题通过调查胃癌病人血清中抗幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin associated gene A,Cag A)抗体的产生情况,检测胃癌组织中结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer1,MACC1)的表达,同时分析胃癌患者IL-17A+/IFN-γ+CD3+T(CD4、CD8、γδT)Th17细胞和相关细胞因子(IL-17A、IL-23、IL-1β、IFN-γ)及其转录因子(RORγt、T-bet)的表达水平,探讨:胃癌病人血清中抗Cag A抗体的产生和分布情况;MACC1与胃癌的关系及临床病理参数的相关性;IL-17A+/IFN-γ+CD3+T细胞及相关细胞因子与胃癌的关系及临床病理参数的关系;并初步探讨其可能的作用机制。方法:1)所有胃癌患者与健康人群对照组外周血标本或手术标本均来自苏州大学附属第二医院,所有胃癌患者均记录性别、年龄及术后临床病理分期资料;2)通过构建幽门螺杆菌Cag A蛋白的原核表达载体,获得Cag A蛋白,通过ELISA方法检测胃癌患者血清中抗Cag A抗体的产生情况;3)采用RT-PCR检测胃癌患者癌组织和癌旁组织中MACC1 m RNA的表达情况,同时利用免疫组化技术分析MACC1在胃癌组织中的表达情况,并分析其与临床病理参数的相关性;4)分离健康人群对照组和胃癌患者外周血单个核细胞(PBMC)(1×106/cells),应用PMA(50ng/ml)+Ionomycin(1μg/ml)+Monensin(500ng/ml)刺激培养5h,采用多色流式细胞仪(BD FACSVerse flow cytometer)分别检测IL-17A+/IFN-γ+CD3+T(CD4、CD8、γδT)细胞频数;5)采用实时荧光定量聚合酶链反应(QRT-PCR)技术,检测外周血PBMC中IL-17A+T细胞主要转录因子RORγt,IFN-γ+T细胞相关的转录因子T-bet及IL-17A+/IFN-γ+T细胞相关细胞因子IL-17A、IL-23、IL-1β、IFN-γm RNA的表达水平;6)采用液相芯片技术和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测胃癌患者和健康人群对照组血清IL-17A、IL-23、IL-1β、IFN-γ浓度;7)采用SPSS19.0软件对胃癌组织与癌旁组织MACC1 m RNA表达水平,IL-17A+/IFN-γ+CD3+T细胞的频数及其相关细胞因子表达水平、胃癌患者临床病理分期等资料进行统计学分析。结果:1)表达制备高纯度的Cag A融合蛋白,利用间接ELISA法,调查发现胃癌患者血清中Cag A抗体的阳性率高达83.3%,且与患者的年龄、性别和肿瘤浸润深度、淋巴结转移等临床病理分期等无显著性差异,同时发现正常健康体检者的Cag A抗体阳性率仅为5%。2)MACC1 m RNA在胃癌组织中阳性率为70%,显著高于癌旁组织,MACC1 m RNA表达与胃癌浸润深度、分化程度及有无淋巴结转移、TNM分期呈正相关,而与年龄、性别、肿瘤大小无关。并且免疫组化实验结果表明,MACC1蛋白在胃癌组织中高表达,而在癌旁组织中基本不表达。3)与健康人群对照组比较,胃癌患者组外周血中Th17、γδT17细胞在CD3+T细胞中的频数显著升高,Tc17细胞在CD3+T细胞中的频数显著降低,且Th17细胞频数与Tc17细胞频数呈负相关;IFN-γ+CD3+CD4+Th1细胞、IFN-γ+CD3+CD8+T细胞及IFN-γ+CD3+γδT细胞在胃癌患者外周血CD3+T细胞中的比例均显著低于健康体检组;4)在外周血Th17、Tc17、IFN-γ+CD3+CD4+T、IFN-γ+CD3+CD8+T细胞的比例与肿瘤的浸润深度(T1+T2/T3+T4)、肿瘤的远处转移(M0/M1)分别存在显著差异;Tc17、γδT17、IFN-γ+CD3+CD8+T及IFN-γ+CD3+γδT细胞在TNM分期(I+II/III+IV)中均存在显著差异;γδT17、IFN-γ+CD3+γδT细胞与肿瘤的淋巴结转移(N0/N1+N2+N3)存在显著差异;5)细胞内IL-17A因子在外周血CD3+T细胞中的来源主要为Th17细胞,其次为Tc17细胞,而γδT17细胞所占比例最少;而细胞内IFN-γ+因子在外周血CD3+T细胞中的来源主要为CD8+T细胞,其次为CD4+Th1细胞,而γδT细胞所占比例最少;6)胃癌患者血清IL-17A、IL-23、IL-1β的浓度显著高于健康人群对照组,而IFN-γ的浓度显著低于健康人群对照组;且IL-17A、IL-23、IL-1β及IFN-γ在肿瘤的淋巴结转移(N0/N1+N2+N3)和TNM分期(I+II/III+IV)中均存在显著差异;IL-23、IL-1β、IFN-γ浓度在肿瘤的浸润深度(T1+T2/T3+T4)中分别存在显著差异;IL-1β浓度在肿瘤的分化程度(高-中分化/低分化)也存在一定的差异;此外在胃癌患者中血清IL-17A的浓度与Th17细胞的频数密切相关(r=0.3310,p=0.0231);7)IL-17A+CD3+T细胞转录因子的RORγt m RNA在胃癌患者中的表达水平显著高于健康人群对照组;而IFN-γ+CD3+T细胞的转录因子T-bet m RNA表达水平显著低于健康人群对照组(P0.05);结论:1)我国胃癌患者大多数与感染Cag A阳性的幽门螺杆菌有关,血清中Cag A抗体的检测有望成为胃癌高危因素的参考指标;2)MACC1表达与胃癌的浸润深度、分化程度及有无淋巴结转移TNM分期呈正相关,有望成为胃癌诊疗的一个新指标;3)胃癌患者外周血CD3+T细胞中,Th17和γδT17细胞呈高表达,Tc17细胞呈低表达,且细胞内IL-17A的来源主要为Th17细胞,这些IL-17A+CD3+T细胞与肿瘤的病理特征存在相关性;4)胃癌患者外周血CD3+T细胞中,IFN-γ+CD3+CD4+Th1细胞、IFN-γ+CD3+CD8+T细胞及IFN-γ+CD3+γδT细胞呈低表达,且细胞内IFN-γ的来源主要为CD3+CD8+T细胞,这些IFN-γ+CD3+T细胞与肿瘤的病理特征存在相关性;5)胃癌患者血清IL-17A、IL-23、IL-1β的浓度和m RNA表达水平及转录因子(RORγt)m RNA表达水平均显著高于健康人群对照组;血清IFN-γ的浓度和转录因子(T-bet)m RNA表达水平均低于健康人群对照组,且与肿瘤的病理特征存在相关性。
【图文】：

增cagA基因片段；泳道2： 标准DNA2 cagA基因PCR扩增结建及鉴定 将cagA亚克隆隆经酶切及PCR鉴定，目的 和 850bp 左右，证实表达

2. 重组质粒pet28a/cagA的构建及鉴定 将cagA亚克隆到原核表达载体pet28a多克隆位点中(Nco I和Sal I)，重组克隆经酶切及PCR鉴定，目的片段大小与预期相符，，阳性克隆酶切条带分别为3000bp 和 850bp 左右，证实表达载体构建成功（图3）。泳道1：标准DNA Marker (DL2000)；泳道2： 阳性质粒双酶切；泳道3： PCR鉴定图3 重组质粒pet28a/cagA的鉴定2.3 测序结果及分析 克隆出的目的基因测序显示，其编码区为852bp，编码284个氨基酸残基，部分测序结果见图4。与GeneBank已收录的CagA蛋白编码基因序列比较，同源性达100%。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

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本文编号：2694037