非小细胞肺癌的缺氧耐受性及其PDHA1和GBP1表达的临床病理研究

发布时间：2020-06-03 09:01

【摘要】：肺癌是世界范围内癌症死亡的主要原因,由于快速增长的烟草消费,发展中国家肺癌的发病趋势在增加。然而,非吸烟患者也占据了所有肺癌的25%。传统上,吸烟对男性的影响超过女性,但是由于近代女性的吸烟人群增多,导致女性肺癌增加且更易发生腺癌。其中,非小细胞肺癌是肺癌最常见的组织学类型,约占肺癌总数的80-85%。尽管出现诸多新的治疗聚焦于肺癌,但是总体生存率的提高并不明显。辨别调节肿瘤细胞增殖、浸润和转移的关键基因及蛋白,并研究其内在分子机制是十分重要的。尽管我们的课题组之前的研究提示GBP1和PDHA1在其它肿瘤中具有重要的相互作用,二者在非小细胞肺癌中的研究还未见报道。丙酮酸是三羧酸循环、糖酵解和磷酸戊糖途径的关键代谢中间产物,而线粒体介导的丙酮酸氧化过程是真核细胞中糖、脂肪酸和氨基酸代谢途径的核心。在人体细胞中,葡萄糖的糖酵解过程产生丙酮酸,继而有多个载体蛋白和酶复合物参与丙酮酸的分解代谢,其中PDHA1也就是丙酮酸脱氢酶(Pyruvate Dehydrogenase,PDH)E1α亚单位属于关键性枢纽。葡萄糖代谢生成的丙酮酸,首先由位于线粒体内膜上的丙酮酸转运载体(mitochondrial pyruvate carrier,MPC)自胞浆转运进入线粒体基质,随后在丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex,PDC)的作用之下,生成乙酰-CoA进入三羧酸循环进行氧化磷酸化。其中丙酮酸脱氢酶E1α亚单位(PDHA1)的磷酸化和去磷酸化,决定PDC失活和激活。PDHA1蛋白的正常表达是线粒体中三羧酸循环和氧化磷酸化正常进行的前提条件。细胞中的线粒体氧化磷酸化和糖酵解是两大产能途径,其中丙酮酸起到联系糖酵解和三羧酸循环的功能,干扰丙酮酸的代谢可能改变线粒体氧化磷酸化和糖酵解相对比率。在1920s,Otto Warburg提出了惊人的发现,即有氧糖酵解(Warburg效应)是肿瘤的主要代谢特点。即使在氧充足的情况下,肿瘤细胞也倾向糖酵解代谢。与氧化磷酸化比较,有氧糖酵解看起来似乎有悖于正常细胞的糖代谢,是一个低效产生ATP的途径。尽管有氧糖酵解现在已经被广泛接受为肿瘤的代谢特征,而且Warburg效应是肿瘤领域的研究热点,其与肿瘤进展的内在机制至今仍不太清楚。因此,深入研究肿瘤代谢,探索细胞的所有小分子路径的相互作用,可以揭示有利于肿瘤细胞存活和繁殖的独特微环境。有研究表明PDC活性降低后,PDHA1活性也随之下降,失去了将丙酮酸转化为乙酰-CoA的作用,进而造成大量乳酸堆积。其中PDHA1的活性位点被抑制后可调节PDC与PDH活性,进而使Warburg效应增强,肿瘤细胞的侵袭性增强。我们课题组前期对前列腺癌、卵巢癌中的PDHA1基因进行了相关研究,发现缺氧可以导致PDHA1表达下降及GBP1表达增强,并且使肿瘤细胞干性增强。GBPs(guanylate-binding protein,P65家族)是一类主要的干扰素诱导基因,与p47家族、MX家族同属于鸟苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase,GTPase)超级大家族。GBPs可以强化宿主免疫蛋白功能,包括吞噬细胞氧化酶、抗菌肽和自噬效应蛋白从而消灭细胞内病原体。而鸟苷酸结合蛋白1(guanylate-binding protein 1,GBP1)属于一大类GTPase,通过炎症因子刺激,由IFN-γ诱导产生,对病原微生物也具有较好的抵抗力。国外的学者通过GBP1与肿瘤进展关系的研究发现,GBP1表达可以增加表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)刺激、促进EGFR表达,并且通过刺激P38MAPK信号传导及EGFRVIII促进GBP1的转录水平表达。GBP1单独表达可充分增加细胞增殖、血管生成、减少凋亡。因此,GBP1可能是一个新的致瘤基因。已有研究表明,肿瘤细胞可以通过代谢重编程包括降低PDHA1的活性来加强糖酵解,促进肿瘤细胞的增殖和转移。因此,PDHA1及GBP1的表达可能在某种程度上具有一定的反向相关性,两者的表达对非小细胞肺癌的发生及侵袭、转移等生物学行为值得研究。肿瘤细胞或多或少的处于缺氧的微环境中,缺氧能维持肿瘤的未分化状态,减慢肿瘤的生长,使其处于休眠期,尤其是可以诱导分化的肿瘤细胞“去分化”而获得干性。日益增加的证据证明肿瘤是一种与干细胞相关的疾病。肿瘤细胞干性增强,促进了肿瘤的生长、浸润、转移和复发的潜力。本课题是通过缺氧环境下对非小细胞肺癌细胞株的培养,检测缺氧、PDHA1及GBP1三者之间的关系及其对非小细胞肺癌恶性表征的影响,并通过基因沉默技术对PDHA1和GBP1表达的相互影响关系进行了实验研究。我们的研究发现,PDHA1的低表达以及GBP1的高表达与非小细胞肺癌的恶性临床病理指标和预后差相关;在低氧状态下幸存下来的非小细胞肺癌细胞下调了PDHA1的表达,但是GBP1却在这些细胞中显著上调;通过非小细胞肺癌细胞系的进一步基因沉默实验发现,沉默PDHA1 48小时后,GBP1的基因和蛋白表达得到显著上调,而沉默GBP1 48小时后未见PDHA1的表达变化。综上研究提示PDHA1可以直接或间接参与GBP1的负反馈调节,而PDHA1的低表达和GBP1的高表达是非小细胞肺癌的恶性预后因子。第一部分非小细胞肺癌组织中PDHA1及GBP1表达与临床病理特征及预后的关系目的探索非小细胞肺癌组织中PDHA1及GBP1蛋白水平表达的临床意义及与预后的关系。方法1.回顾性分析了2011年1月至2013年12月期间郑州大学第一附属医院手术切除组织证实为非小细胞肺癌的102例患者的临床资料。2.采用免疫组化方法检测癌组织及对应癌旁组织PDHA1及GBP1蛋白的表达。3.分析PDHA1及GBP1蛋白表达与临床病理特征之间的关系,并对两种蛋白的表达作出相关性分析。4.随访和生存分析,确定PDHA1及GBP1蛋白表达情况、不同分化程度、淋巴结是否转移、TNM分期对总生存期的影响。结果1.PDHA1蛋白在非小细胞肺癌组织中的阳性表达率为39.2%(40/102),在对应的癌旁组织中的阳性表达率为82.4%(84/102)。PDHA1蛋白在非小细胞肺癌组织中的阳性表达率显著低于癌旁组织(χ~2=39.813,P0.05)。GBP1蛋白在非小细胞肺癌组织中的阳性表达率为65.7%(67/102),在对应的癌旁组织中的阳性表达率为33.3%(34/102)。GBP1蛋白在非小细胞肺癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织(χ~2=21.355,P0.05)。2.在非小细胞肺癌组织中,PDHA1蛋白及GBP1蛋白的表达与患者性别、吸烟史及病理类型无关,而与组织分化程度、淋巴结是否转移及TNM分期有关。PDHA1及GBP1蛋白的表达存在负相关性。3.PDHA1及GBP1蛋白的表达、组织分化程度、淋巴结是否转移及TNM分期均与非小细胞肺癌预后有关(P0.05)。结论随着非小细胞肺癌的进展,PDHA1蛋白表达下降,而GBP1蛋白表达升高,并且两者均可影响预后,可以作为判断预后的潜在指标。第二部分非小细胞肺癌组织中PDHA1及GBP1 mRNA及蛋白表达水平的检测及临床意义目的研究非小细胞肺癌新鲜组织中PDHA1及GBP1 mRNA及蛋白表达水平及其临床相关意义。方法1.收集20例配对的肺癌及癌旁组织,运用Realtime RT-PCR检测非小细胞肺癌及癌旁组织PDHA1及GBP1基因mRNA水平的表达情况及二者的相关性分析。2.Western blot检测非小细胞肺癌及癌旁组织PDHA1及GBP1蛋白的表达情况。结果1.在配对的肺癌标本中,相对于癌旁组织,早期癌PDHA1mRNA表达降低,晚期癌表达更低(P0.05)。早期癌GBP1mRNA表达增高,晚期癌表达更高(P0.05)。两者呈低度负相关(P0.05)。2.不同TNM分期的非小细胞肺癌及癌旁组织的PDHA1和GBP1蛋白表达存在显著差异(P0.05)。结论PDHA1低表达和GBP1高表达与非小细胞肺癌的发生、发展有关,可作为判断非小细胞肺癌生物学行为的重要参考指标。第三部分缺氧对非小细胞肺癌细胞株PDHA1及GBP1表达的影响目的通过缺氧环境下对非小细胞肺癌细胞株的培养,检测缺氧、PDHA1及GBP1三者之间的关系及其对恶性表征的影响。方法1.肺鳞癌细胞株LC-42及肺腺癌细胞株SELS分别正常氧(20%O_2)及低氧(1%O_2)条件下培养。2.20%O_2组及1%O_2组两种肺癌细胞系的细胞形态学观察、生长曲线及倍增时间测定。3.Western blot检测20%O_2组及1%O_2组两种肺癌细胞系的PDHA1和GBP1蛋白的表达。4.Transwell侵袭实验检测20%O_2组及1%O_2组两种肺癌细胞系的体外侵袭能力。5.克隆形成实验检测20%O_2组及1%O_2组两种肺癌细胞系的体外克隆形成能力。结果1.1%O_2组的两种肺癌细胞系,细胞均出现生长缓慢,DT延长。20%O_2组及1%O_2组的两种肺癌细胞系的DT差别均具有统计学意义(P0.05)。2.随着环境中氧含量的降低,PDHA1蛋白表达减少,而GBP1蛋白表达增加。20%O_2组及1%O_2组的两种肺癌细胞系PDHA1和GBP1蛋白表达存在显著差异(P0.05)。3.Transwell小室侵袭实验结果显示:1%O_2组肺鳞癌细胞株LC-42的细胞穿膜数为(3014.6±521.1);20%O_2组的细胞穿膜数为(1837.2±796.4);两者差异有统计学意义(P0.05)。肺腺癌细胞株SELS在1%O_2组细胞穿膜数为(3812.2±809.9),而在20%O_2组为(1501.7±378.2),两者差异有统计学意义(P0.05)。4.肺鳞癌细胞株LC-42 20%O_2组克隆形成率为15.6±4.2%,1%O_2组克隆形成率为32.9±6.9%,两者差异有统计学意义(P0.05)。肺腺癌细胞株SELS 20%O_2组克隆形成率为18.1±5.6%,1%O_2组克隆形成率为36.4±5.6%,两者差异有统计学意义(P0.05)。结论1.缺氧导致了肺鳞癌及腺癌细胞PDHA1蛋白表达下降,GBP1蛋白表达上调。2.缺氧、PDHA1下调及GBP1上调共同参与了肺鳞癌及腺癌细胞恶性生物学行为增强。第四部分非小细胞肺癌细胞株中PDHA1及GBP1表达相互关系的研究目的通过siRNA基因沉默技术研究抑制PDHA1的基因表达后对GBP1基因和蛋白表达的影响,以及沉默GBP1基因后对PDHA1基因和蛋白表达的影响规律,从而间接探索二者基因活性的相互关系。方法1.细胞准备:肺鳞癌细胞株LC-42及肺腺癌细胞株SELS,采用6孔细胞培养板,在37℃、5%CO_2、饱和湿度条件下的CO_2培养箱中,用含10%FBS的RPMI 1640培养液培养24小时至70%细胞融合备用。2.基因沉默使用圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)的相关试剂进行。3.细胞经siRNA转染试剂转染48小时后,收集样品。4.对siRNA转染48小时的细胞采用RT-PCR分析细胞中的PDHA1以及GBP1mRNA的表达。5.对siRNA转染48小时的细胞采用免疫细胞化学进一步分析细胞中的PDHA1以及GBP1蛋白的表达。6.对siRNA转染48小时的细胞经Western blot分析细胞中的PDHA1以及GBP1蛋白的表达。结果1.当有效沉默非小细胞肺癌中的PDHA1的表达后,GBP1的基因和蛋白的表达得到有效激活,表达水平显著上调。2.但是,当有效沉默非小细胞肺癌中的GBP1的表达后,PDHA1的基因和蛋白的表达没有明显的差异。3.上述研究结果在LC-42和SELS两组细胞中结果类似。结论1.GBP1是PDHA1的下游基因。2.PDHA1直接或者间接参与了GBP1基因的负调控。
【图文】：

肺鳞癌组织,肺腺癌,性表达,中阳

图1.1 NSCLC癌及癌旁组织中PDHA1及GBP1蛋白的表达) PDHA1 在肺鳞癌组织中阳性表达（×400）；) PDHA1 在肺腺癌组织中阳性表达（×200）；) GBP1 在肺鳞癌组织中阳性表达（×400）；) GBP1 在肺腺癌组织中阳性表达（×200）；) PDHA1 在 NSCLC 癌旁组织中阳性表达（×200）；表 1.1 PDHA1 蛋白及 GBP1 蛋白在非小细胞肺癌及癌旁组织的表达组织类型例数PDHA1蛋白 GBP1蛋白+ - χ2P + - χ2P癌组织 102 40 6239.813 ＜0.0567 3521.355 ＜0癌旁组织 102 84 18 34 68(B) PDHA1 在肺鳞癌组织中弱阳性表达（×400）(D) PDHA1 在肺腺癌组织中弱阳性表达（×400）(F) GBP1 在肺鳞癌组织中弱阳性表达（×400）(H) GBP1 在肺腺癌组织中弱阳性表达（×400）(J) GBP1 在 NSCLC 癌旁组织中阴性表达（×200）

临床病理特征,非小细胞肺癌,阴性

PDHA1阳/阴性表达对NSCLC总生存期的影响
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

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