肝癌相关抗原SMP30联合GP96修饰树突状细胞诱生CTL抗肝癌作用的研究

发布时间：2020-06-03 10:03

【摘要】：背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤之一,其死亡率占我国癌症死亡率第三位。手术、放疗及化疗是目前治疗HCC的三大常规方法,但疗效仍不理想,寻找更有效而安全的疗法成为HCC治疗的新趋势。纵观肿瘤治疗研究历程,以肿瘤免疫治疗为代表的生物治疗在控制肿瘤复发转移的过程中可发挥重要作用,而以树突状细胞(dendritic cell,DC)介导的肿瘤免疫治疗有良好的前景。因为DC细胞是最强大的抗原提呈细胞,能有效提呈特异性抗原给T细胞,诱生特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)。本课题组前期应用SEREX(重组c DNA表达文库的血清学分析技术),从广西人肝细胞癌c DNA文库中筛选出多种编码HCC肿瘤相关抗原基因的克隆,DNA测序发现其中一种抗原与SMP30羧基末端165个氨基酸是同源结构,相应抗体主要见于HCC患者,尤其有趣的是在甲胎蛋白阴性的肝癌患者发现有SMP30抗体高阳性检测率。我们利用重组表达的SMP30蛋白致敏人DC发现其能有效刺激自体T淋巴细胞的增殖,且可诱导生成对肝癌细胞株BEL-7404有一定杀伤效应的CTL。我们的研究小组较早地显示SMP30在HCC癌旁组织中高度表达,但在HCC组织中具有低水平。糖蛋白96(gp96)属于热休克蛋白90(HSP90)家族,是免疫治疗中众所周知的佐剂。HSP-抗原复合物可以通过抗原呈递细胞如树突细胞以受体介导的方式相当有效地摄取。同时,HSP-抗原肽复合物中的抗原或HSP与树突细胞相互作用,刺激树突状细胞表达MHC II类分子,分泌细胞因子和趋化因子,导致树突状细胞成熟并迁移到引流淋巴结,向T细胞呈递抗原,启动CTL应答。因此,基于其佐剂作用的HSP制剂疫苗在癌症或传染病的免疫治疗中引起更多关注。另外,HSP能诱导记忆性T细胞产生,作用更持久。在III期临床试验中,GP96已被证明对CTL细胞有高效促进作用,具有良好的抗癌作用。在国内外相关研究报道中,目前采用的增强肿瘤抗原免疫原性的方式主要包括体外合成肿瘤抗原肽、完全肿瘤抗原负载DC以及肿瘤抗原基因转染DC等。肿瘤病人免疫功能各环节是减弱的,不管是APC表面受体,还是肿瘤抗原及其伴侣分子,或是MHC-I类分子均有可能不利于肿瘤抗原加工和递呈,从而影响CTL细胞形成。采用体外冲击致敏DC的方法具有直接、起效快等特点,但难以诱导持久抗肿瘤免疫反应。将肿瘤抗原的基因导入DC后可使抗原表达持久,容易进入MHC-I类抗原呈递途径。因此,将表达肿瘤抗原肽的基因的载体转染DC构建的肿瘤疫苗具有相当的优势。目的:目前国内外先后报道了一些肝癌相关抗原负载DC疫苗的研究,甲胎蛋白(AFP)是目前公认的肝癌标志物,尽管有研究表明AFP基因转染DC可诱导特异性CTL靶向杀伤AFP阳性的肝癌细胞,但其免疫反应强度仍距临床应用很远;日本研究者用HSP70 m RNA转染DC,进行12例肝癌免疫治疗I期临床试验,但这种技术涉及RNA容易降解,且单基因修饰DC疫苗的效果也很有限。因此,目前基于DC疫苗的肝癌免疫治疗并不能令人满意,仍然有很多工作要做。基于现有文献报道和我们的前期研究,我们提出科学假说,人肝癌相关抗原SMP30蛋白基因与GP96基因联合转入DC可持续使其致敏并可增强DC抗原呈递功能,成为更强有效的特异性抗肝癌疫苗。本研究旨在探讨SMP30联合GP96负载DC诱生CTL能否增强抗肝癌免疫效应。加上我们以前的研究结果,进一步了解SMP30在HCC免疫治疗中的作用,为开展以SMP30作为干预靶点的研究提供实验依据。方法:我们用生物信息学技术查询基因序列,将SMP30和GP96基因片段先后导入慢病毒载体构建真核重组子,然后转染健康志愿者DC,将实验组分为smp30-gp96组,GP96组,SMP30组,DC组,空载体组,肝癌组织提取液孵育DC组。流式细胞术评估转染前后DC的CD80和CD86及CCR7变化。用DC疫苗和T细胞共培养,得到相关的CTL,其上清液用ELISA检测肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素(IFN)等细胞因子。并与靶细胞人肝癌细胞株SMMC7721混合培养,流式细胞仪检测CTL杀伤效应。将5-6周龄的雌性BALB/c裸鼠(无特殊病原体,SPF)皮下(s.c.)注射SMMC-7721细胞(13107个)到小鼠的右侧腹皮下,每隔4天注射一次,注射两次成瘤后,第9天将小鼠随机分配为实验组和对照组,每组4只小鼠。实验组肿瘤块内注射gp96-smp30修饰DC诱生的CTL(13108),CTL每隔一天皮下注射一次,总共七次。该实验重复3次。对照组注射PBS。16天后使动物安乐死,称重移植瘤,对照各组小鼠的肿瘤生长变化与小鼠存活情况、血清免疫指标改变情况。观察肿瘤内组织变化。结果:SMP30和GP96基因片段能先后导入同一慢病毒载体,转染DC后使其表达更多CCR7、CD86和CD80等表面分子,分泌更多IL-1及IFN-γ;smp30-gp96组、SMP30组和肝癌组织裂解液组DC诱生的CTL分泌的细胞因子(INF-α,INF-γ,TNF-α,TNF-β和IL-12等)比空载组和空白组更多。有显著性差异(P0.05/0.01);但这三组之间无显著性差异。所诱生的CTL对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞具有更强杀伤效应。荷人瘤小鼠体内试验显示,gp96-smp30转染DC诱生的CTL也能有效减小小鼠荷人肝癌瘤体,血清中检测到更多INF-γ和IL-6,肿瘤组织内肝癌细胞凋亡增多。结论:我们成功将SMP30和GP96基因片段先后导入慢病毒载体构建双目的基因真核重组子;SMP30和GP96双目的基因组(混合组)、SMP30组和裂解液组与空载组和空白组相比,促进DC成熟;加强抗原提呈能力。混合组、SMP30组和裂解液组致敏的DC都能显著促进T细胞增殖;混合组、SMP30组和裂解液组DC诱生的CTL与空载组和空白组相比,对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞具有更强杀伤效应;体外实验表明:混合组与单独的SMP30组相比,致敏DC作用(产生表面分子CCR7,CD86和CD80以及分泌IFN-γ和IL-1)、促进T细胞增殖作用、诱生CTL并分泌细胞因子(INF-α,INF-γ,TNF-α,TNF-β和IL-12)以及对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞杀伤效应等作用,基本无显著性差异;但与gp96组相比呈现出有显著增强的趋势;综合本研究结果初步表明:SMP30和GP96双目的基因组(混合组)与裂解液组有相同的抗HCC效果。但两组的特异性和毒副作用有待进一步比较;单独SMP30抗HCC效果作用强于单独gp96作用;混合组抗HCC作用,体内实验效果优于体外实验,SMP30与GP96都能介导慢病毒促进DC成熟,进而诱生CTL,且两者可能有协同作用。GP96与SMP30分别介导慢病毒共转染DC,可以协同刺激DC促进其成熟,加强抗原提呈能力,进而可诱生CTL并产生更多IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β和IL-12,获得更好的体内外抗人肝癌细胞株SMMC-7721细胞作用。
【图文】：

结构示意图,树突状细胞

GP96慢病毒载体结构示意图(GP96lentiviralvectorstructure)

结构示意图

SMP30慢病毒载体结构示意图(SMP30lentiviralvectorstructure)
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

【相似文献】