EZH2通过与Aiolos相互作用抑制NK细胞的抗肿瘤活性

发布时间：2020-06-06 08:03

【摘要】：目的:组蛋白甲基转移酶EZH2催化染色体组蛋白H3K27me3修饰的发生,通过影响下游基因的表观遗传修饰状态在基因的转录水平对细胞的基因表达程序进行调控,在维持细胞的正常发育与功能状态方面发挥着关键性作用。EZH2的异常表达与多种肿瘤的发生具有密切的相关性。肿瘤的发生与发展除与肿瘤细胞本身相关之外,很大程度上还依赖于肿瘤微环境,但在肿瘤微环境内的EZH2表达水平与肿瘤发生发展的相关性及相关性背后的相关机制仍有待研究。我们以临床肺癌患者的肿瘤样本与Ezh2敲除小鼠模型为研究对象,证明与解析肿瘤微环境中EZH2的表达水平与肺癌发生及转移的关联,并开展大量分子层面的实验探索,希望通过该研究为肿瘤的诊断与治疗提供新的思路。方法:1.我们利用免疫组化的方法分析患者临床肿瘤样本,分析肿瘤微环境中EZH2的表达情况与肺癌临床分级以及患者预后存在的关联。2.利用诱导性Ezh2敲除小鼠,分析Ezh2全身性敲除对于小鼠NK细胞与T淋巴细胞比例的影响;构建小鼠肺癌转移模型,分析Ezh2敲除对于肿瘤细胞远端转移的影响;从小鼠腹水内制备NK细胞特异性中和抗体,特异性去除小鼠体内NK细胞,分析Ezh2敲除对于小鼠体内NK细胞抗肿瘤活性的影响;并使用免疫荧光的实验手段分析小鼠肿瘤组织切片内NK细胞与T淋巴细胞的分布,原位观察Ezh2敲除对小鼠肿瘤微环境的影响。3.在293T细胞内使用IP-质谱的方法鉴定与EZH2相互作用的蛋白中是否存在有Aiolos;使用Co-IP对小鼠脾脏NK细胞内EZH2与Aiolos之间的相互作用进行验证;使用Duolink方法分别在小鼠脾脏NK细胞与NK92细胞系内原位检测EZH2与Aiolos的相互作用;构建截短突变型Aiolos,使用Co-IP与Duolink实验手段在293T细胞中鉴定Aiolos与EZH2发生相互作用的关键结构域。4.利用文献报道中Ikzf3与Ezh2基因敲除小鼠的NK细胞基因表达谱的数据,鉴定Aiolos与EZH2的潜在共同调控基因,并进行功能分析;使用染色体免疫共沉淀的方法鉴定Aiolos与EZH2对于上述基因的转录起始位点的富集情况;使用Aiolos抑制剂沙利度胺处理小鼠脾脏NK细胞,观察Aiolos被下调后上述基因的表达水平是否受到影响,同时检测抑制Aiolos对EZH2以及组蛋白修饰H3K27me3在上述基因转录起始位点富集情况的影响;使用Aiolos抑制剂处理后检测小鼠NK细胞的体外肿瘤杀伤活性。结果:1.肺癌患者临床样本分析发现肿瘤微环境中EZH2低表达水平的肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte)的数量与患者生存期呈正相关,与患者发生肿瘤淋巴结转移的情况呈负相关,但与肿瘤临床分级无显著相关性。2.利用ERT2-Cre转基因小鼠与Ezh2fl/fl小鼠进行杂交最终获得基因型为ERT2cre Ezh2fl/fl的Ezh2诱导型基因敲除小鼠,并发现Ezh2敲除之后小鼠对于肺癌细胞转移的抑制能力显著增强,且可以导致小鼠脾脏中NK细胞的比例上升,T细胞比例无明显变化趋势;NK1.1抗体介导的NK细胞消除使得Ezh2敲除小鼠对LLC1细胞造成肺部结节的抑制优势消失。3.IP-质谱实验发现可以与EZH2发生的共沉淀蛋白中包含Aiolos;在小鼠脾脏NK细胞中进行Co-IP发现EZH2与Aiolos存在相互作用;在小鼠NK细胞与NK92细胞系中进行Duolink实验发现EZH2与Aiolos在原位存在相互作用;在293T细胞中转染截短突变型Aiolos与EZH2,Co-IP实验发现当Aiolos第七个外显子缺失二者间相互作用消失;Duolink实验发现当Aiolos第七个外显子缺失二者间的胞内共定位消失。4.对小鼠NK细胞基因表达谱数据分析发现25个基因在Ikzf3与Ezh2敲除后都发生上调,其中Tcf7、Icos、Gpr5 与Marks曾被报道与NK细胞发育与功能相关;CHIP实验发现Aiolos与EZH2在上述基因的启动子存在富集;使用沙利度胺抑制小鼠NK细胞中的Aiolos可以导致上述基因的表达上调,同时EZH2与组蛋白修饰H3K27me3在上述基因转录起始位点富集降低;小鼠脾脏NK细胞经过沙利度胺处理后体外肿瘤杀伤能力无显著变化。结论:1.肺癌患者肿瘤微环境中浸润性NK细胞有利于患者获得更积极的预后,有利于延长患者生存期。2.EZH2表达缺失可以通过促进NK细胞的发育提升小鼠体内NK细胞的比例,进而增强抑制肿瘤转移的能力。3.Aiolos介导了 EZH2对NK细胞发育与功能的部分关键性影响,靶向促进了NK细胞的抗肿瘤活性。
【图文】：

Ｅｚｈｌ的表达水平在正常组织与同样来源的肿瘤组织内却没有显著性差异［２］；发逡逑育中的肾脏内存在Ｅｚｈ２的表达，但非分裂状态下的成熟肾脏组织中则无法检测逡逑到Ｅｚｈ２ｐ］（图１）；在小鼠胚胎中，Ｅｚｈ２蛋白在淋巴细胞的生成部位，例如胎肝逡逑和胸腺存在大量富集，而在增殖活跃的生发中心Ｂ细胞（Ｃｅｎｔｒｏｂｌａｓｔｓ）中，Ｅｚｈ２逡逑也存在显著高表达［３］，这提示Ｅｚｈ２与Ｂ细胞的活化与分裂存在相关性。Ｅｚｈ２的逡逑系统性敲除对于转基因小鼠是致死性的［４］，有课题组基于条件性基因敲除技术研逡逑宄Ｅｚｈ２，并发现Ｅｚｈ２通过控制免疫球蛋白／ｇＡ基囡的正常重排，对于Ｂ细胞发逡逑育发挥着决定性的作用［５］（图１）。逡逑Ｍｏｕｓｅ邋Ｋｉｄｎｅｙ逦Ｐｒｏ—Ｂｃｅｌｌｓ邋Ｐｒｅ－Ｂｃｅｌｌｓ邋＇＾｜ｔｕｒｅ邋Ｒｅｄｒｃｕｊａｔｉｎｇ逡逑Ａｇｅ邋（ｍｏｎｔｈｓ）邋ＮＢ邋１逦３逦６逦９逦ｔｏｒ邋３：邋１邋ｔｅ邋３：邋１逦３：邋１邋ｆｃｉ邋３：邋１逡逑抓■—逦Ｅｚｈ２邋二？、逡逑Ｅｚｈ２－｜邋ｍｍ逦Ｅｚｈ１逦？逦？逡逑ＨＰｉｒｒ逡逑２００３邋Ｆｅｂ；４（２）：邋１２４－３１．逡逑Ｍｏｌ邋Ｃｅｌｌ．邋２００８邋Ｎｏｖ邋２１；３２（４）：５０３－１８．逡逑图１，Ｅｚｈ２的表达模式及其与发育的相关性。逡逑左图，小鼠肾脏内Ｅｚｈｌ与Ｅｚｈ２的表达水平随小鼠周龄增长的变化趋势，以逡逑Ｔｕｂｕｌｉｎ为对照内参；右图，在小鼠Ｂ淋巴细胞发育过程中，Ｅｚｈ２与Ｅｚｈｌ的表逡逑达水平变化趋势

项包含７００个病人的临床研宄，ＥＺＨ２被证明与肿瘤细胞的分裂增殖活跃程度相逡逑关［１１］，此外ＥＺＨ２的表达过量可以作为强侵袭性的肿瘤亚型重要标记，，ＥＺＨ２高逡逑表达的肿瘤对应相对缩短的患者生存期（图２）。逡逑ＥＺＨ２ｌｏｗ逦ＥＺＨ２ｈｉｇｈ逡逑ｍｅｌａｎ0ｍａ＿除哆３邋：：——逡逑＝

本文编号：2699394