环状RNA在肝细胞癌中的功能及其诊断价值研究

发布时间：2020-06-06 08:05

【摘要】：近年来的研究表明,环状RNA广泛存在于人体正常组织、癌组织、血清及血浆等。而且已有相关报道显示它们在膀胱癌、胃癌及结肠癌等癌症的进展中发挥了重要作用。然而,环状RNA在肝细胞癌(简称为肝癌)中的作用尚不清楚。在本研究中,我们探索了环状RNA在肝癌中的功能以及诊断价值。我们的研究由下面两个部分组成。在本研究的第一部分,我们利用高通量测序检测了五对肝癌及对应的癌旁组织的环状RNA的表达情况并以cSMARCA5(来自SMARCA5基因第15和第16外显子的环状RNA分子,其在CircBase数据库的编号为hsa_circ_0001445)为代表探索了环状RNA在肝癌中的功能。首先,通过环状RNA测序,我们发现了4727个较高丰度(在肝癌或癌旁组织的平均RPM≥0.1)的环状RNA。它们中的大多数来自外显子,而且大多数长度低于1000个碱基。重要的是,我们在人类肝组织中发现了513个新的环状RNA分子以及236个在肝癌癌旁差异表达的环状RNA分子,其中,108个环状RNA分子在肝癌组织中上调,128个环状RNA分子在肝癌组织中下调。通过实时定量PCR,琼脂糖凝胶电泳以及Sanger测序,我们成功验证了五个在肝癌组织中上调的环状RNA(cDNAJC6,cGPC3,cME1,cPVT1和cSATB2)和五个在肝癌组织中下调的环状RNA(cCYP2C8,cKCNN2,cLIFR,cPIK3R1和cSMARCA5)。其次,通过RNase R(一种5’→3’核酸外切酶,能特异性地消化线性RNA而保留环状RNA)消化实验,放线菌素D转录抑制实验,荧光原位杂交(FISH,fluorescence in situ hybridization)以及实时定量PCR实验等,我们证明了cSMARCA5是一种稳定的、高丰度的,主要存在于细胞质中的环状RNA分子,并且在肝癌组织中的表达低于癌旁组织。第三,通过构建野生型(从第14内含子到第16内含子全部克隆到过表达质粒中)以及I14RC(reverse complementary sequences in intron 14,SMARCA5基因第14内含子上的一段序列,与I16RC反向互补)和(或)I16RC(reverse complementary sequences in intron 16,SMARCA5基因第16内含子上的一段序列,与I14RC反向互补)缺失型的cSMARCA5过表达质粒,实时定量PCR,Northern blot,RNA干扰以及RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)等实验,我们证明了I14RC和I16RC在cSMARCA5的生成过程中是必不可少的,而DHX9(DExH-Box Helicase 9,一种高丰度的细胞核内RNA解螺旋酶)能够通过结合I14RC和I16RC来抑制它们的配对,从而抑制cSMARCA5的形成。另外,DHX9的mRNA和蛋白在肝癌组织的表达高于癌旁组织,并且肝癌组织中DHX9的免疫组化评分与CSMARCA5的表达水平呈正相关。接着,在一个有163名肝癌患者的队列中,我们也证实了cSMARCA5在肝癌组织的下调。我们进一步发现cSMARCA5在肝癌组织中的低表达与侵袭性特征显着相关,包括增加的肿瘤大小(5cm),较差的Edmondson分级,存在微血管侵犯,较晚的TNM及巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期。cSMARCA5的下调表明HCC患者的总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)较短。多因素分析表明cSMARCA5的下调是肝癌患者手术后OS和RFS的独立危险因素。然后,我们利用cSMARCA5过表达质粒在肝癌细胞系中成功地过表达了cSMARCA5,利用靶向其反向剪切位点的小干扰RNA(small interfering RNAs,siRNAs)在肝癌细胞系中成功地干扰了cSMARCA5的表达。CCK-8(Cell Counting Kit-8),细胞划痕、Transwell、皮下荷瘤、肿瘤肝脏原位种植肝内转移以及尾静脉注射肺转移等实验表明过表达cSMARCA5能抑制肝癌细胞的增殖和转移。CCK-8(Cell Counting Kit-8)、细胞划痕和Transwell等实验表明干扰cSMARCA5能促进肝癌细胞的增殖和转移。最后,通过miRanda软件预测、AGO2抗体的RIP实验、circRIP实验、双荧光素酶报告系统、生物素标记的microRNA捕获以及RNA荧光原位杂交实验等,我们证明了cSMARCA5能结合miR-17-3p及miR-181b-5p。通过查阅文献以及实验验证,我们发现过表达或干扰cSMARCA5之后,miR-17-3p和miR-181b-5p的共同靶基因TIMP3变化最明显。因此,我们假设cSMARCA5主要是通过吸附miR-17-3p和miR-181b-5p来保护TIMP3不受降解,从而上调TIMP3,起到抑制肝癌生长和转移的作用。为了验证这个假设,我们进行了一系列的实验。首先,我们发现miR-17-3p和(或)miR-181b-5p对TIMP3的降解作用可以被cSMARCA5所阻断。其次,CCK-8增殖实验表明miR-17-3p和(或)miR-181b-5p对肝癌细胞增殖的促进作用可以被cSMARCA5所阻断。而Transwell实验表明miR-17-3p和(或)miR-181b-5p对肝癌细胞转移的促进作用可以被cSMARCA5所阻断。另外,TIMP3的mRNA水平在肝癌组织中的表达量低于癌旁,并且与cSMARCA5的表达量呈正相关关系。综上所述,cSMARCA5(至少部分)通过miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制肝癌的生长和转移。综上所述,环状RNA cSMARCA5能抑制肝癌的生长和转移,是潜在的肝癌治疗靶点。在本研究的第二部分,我们用环状RNA芯片检测了五例乙肝相关肝癌(简称肝癌)及五例慢性乙型肝炎(简称慢乙肝)患者的血浆。我们发现了371个差异表达的环状RNA分子,其中326个在肝癌血浆中高于慢乙肝血浆,45个在肝癌血浆中低于慢乙肝血浆。将326个上调的环状RNA与肝癌组织中检测到的环状RNA取交集后,我们获得了10个候选环状RNA分子。通过实时定量PCR,琼脂糖凝胶电泳,Sanger测序,RNase R消化以及室温孵育等实验,我们成功鉴定出了其中的四个(hsa_circ_0000976,hsa_circ_0003506,hsa_circ_000775和hsa_circ_0139897),证明它们是环状的并稳定存在于血浆和肝组织中。我们检测这四个分子在肝组织的表达时使用的是实时定量PCR,以β-actin为内参。由于血浆RNA没有公认的内参,我们检测这四个分子在血浆中的表达时使用的是绝对实时定量PCR。结果表明,hsa_circ_0000976和hsa_circ_0007750这两个环状RNA分子不仅在肝癌患者血浆中的表达量高于健康人、慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者,在肝癌手术前血浆中的表达量高于手术后,而且在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量呈正相关关系,在肝癌组织中的表达量高于癌旁组织。hsa_circ_0139897虽然在肝癌及癌旁组织的表达量未见显著差异,但是其在肝癌患者血浆中的表达量高于健康人、慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者,在肝癌手术前血浆中的表达量高于手术后,而且在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量呈正相关关系。我们推测这可能是因为肝癌组织中的hsa_circ_0139897比癌旁或健康组织中的hsa_circ_0139897更容易分泌到血浆中。因此,我们选择hsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897这3个环状分子作为肝癌诊断标志物进一步研究。我们通过Cut off Finder(http://molpath.charite.de/cutoff/)网站的ROC曲线(Euclidean distance)分析法确定了血浆中hsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897用于区别肝癌和非肝癌的最佳截断(cut off)点分别为1067,4324以及1108 copies/ml plasma,大于或等于这些cut off值的记为1,诊断为肝癌,而小于这些cut off值的记为0,诊断为非肝癌。为了提高诊断效果,我们将这三个环状分子的组合(Panel of circRNAs,简称CircPanel)用于诊断肝癌。我们在两个独立的大规模队列(训练集:158名乙肝相关肝癌患者,53名健康人,52名慢性乙型肝炎患者和50名乙肝肝硬化患者;验证集:152名乙肝相关肝癌患者,50名健康人,54名慢性乙型肝炎患者和50名乙肝肝硬化患者)中用ROC曲线(receiver operating characteristic curve,受试者工作特征曲线)下面积(Area Under Curve,AUC),对血浆CircPanel的肝癌诊断效果进行了评价。CircPanel在区别肝癌组与非肝癌组时比AFP具有更高的诊断价值(训练集:AUC0.863[95%CI 0.819 0.907]vs 0.790[0.738 0.842],P=0.036;验证集:AUC 0.843[0.796 0.890]vs 0.747[0.691 0.804],P=0.011),而CircPanel与AFP的联合进一步提高了诊断价值(训练集:AUC 0.878[0.836 0.920]vs 0.790[0.738 0.842],P=0.010;验证集:AUC 0.863[0.819 0.908]vs 0.747[0.691 0.804],P=0.002)。CircPanel在区别小肝癌(单发,直径≤3cm)组与非肝癌组时也比AFP具有更高的诊断价值(训练集:AUC0.862[0.796 0.928]vs 0.680[0.589 0.770],P=0.001;验证集:AUC 0.838[0.776 0.900]vs 0.699[0.613 0.785],P=0.011),而CircPanel与AFP的联合进一步提高了诊断价值(训练集:AUC 0.873[0.817 0.929]vs 0.680[0.589 0.770],P0.001;验证集:AUC 0.874[0.823 0.925]vs 0.699[0.613 0.785],P=0.001)。重要的是,CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与非肝癌组(训练集:AUC 0.838[0.761 0.914],验证集:AUC 0.857[0.793 0.922])以及AFP阴性小肝癌组与非肝癌组(训练集:AUC 0.881[0.797 0.965],验证集:AUC 0.897[0.827 0.968])时也具有较高的诊断价值。我们还将非肝癌组划分为健康组,慢乙肝组和乙肝肝硬化组,并对CircPanel在下列几对比较时的诊断价值进行了评价:肝癌组与健康组、肝癌组与慢乙肝组、肝癌组与乙肝肝硬化组、小肝癌组与健康组、小肝癌组与慢乙肝组以及小肝癌组与乙肝肝硬化组。综上所述,由外周血血浆三个环状(RNA hsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897)所组成的组合CircPanel具有较高的诊断价值,可以单独或与AFP联合使用,并且能用于小肝癌以及AFP阴性肝癌的诊断。
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图 1-1. 人类肝癌及癌旁组织环状 RNA 的测序及鉴定Fig. 1-1. Identification of circular RNAs by RNA-seq analyses in human liver tissues.(A) Most of the circRNAs identified in our study were overlapped with circBase. (B)Genomic origin of the circRNAs identified in human liver tissues. (C) The lengthdistribution for exonic circRNAs. (D) Clustered heat map of the differentially expressedcircRNAs in five paired HCC (T1-T5) and ANL (N1-N5) tissues. Rows represent circRNAswhile columns represent tissues. (E) We validated the differential expression of 10 circRNAsin 40 paired HCC and ANL tissues using qRT-PCR. Wilcoxon signed-rank test was used.

图 1-2. 被选择的 10 个环状 RNA 分子的鉴定Fig. 1-2 The validation of the 10 selected circRNAs. (A) Schematic representation ofthe PCR strategy used to specifically detect circular transcripts. PCR primers weredesigned to be divergent on linear cDNA thereby rendering amplification impossible.However, on cDNA derived from circRNA these primers are convergent, leading to acircRNA-specific amplicon. (B) Melting curves of qRT-PCR product of verified circRNAs,indicating the specificity of qRT-PCR products with no primer dimers or nonspecificamplified products. (C) RT-PCR products with divergent primers showing a single, distinctproduct of the expected size. (D) Sanger sequencing showing the back-spliced events ofcandidate circRNAs. (E) qRT-PCR showing resistance of circRNAs to RNase R digestion.β-actin mRNAserved as a negative control.（二）肝癌中环状 RNAcSMARCA5 的特性我们选择了一个来源于 SMARCA5 基因第 15 和 16 外显子的环状 RNA 分子（命
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
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本文编号：2699397