汉防己甲素诱导白血病细胞分化及其分子机制的研究

发布时间：2020-06-07 02:47

【摘要】：癌症是威胁人类健康的重大疾病,世界卫生组织下属的官方癌症研究机构负责统计了 2014年最新的世界癌症病例,预计每年都会有1410万人发展成为癌症患者,而且癌症尤其是在发展中国家具有很高的致死率。其中,白血病是一种发病率很高,危害性极大的造血干细胞恶性克隆性疾病,白血病的致病病因主要有病毒感染、化学因素、辐射诱导、染色体畸变等因素。目前,白血病的治疗手段主要有化学治疗、靶向治疗、免疫治疗、干细胞移植等。现如今临床上用于治疗白血病的化疗药物主要以促进细胞分化为主,但是随着用药时间延长以及用药量的增加,白血病细胞对化疗药物产生抗药性的几率也在增加,因此寻找新的化疗药物对白血病的治疗具有重要意义。许多传统中药被发现具有良好的抗肿瘤作用,汉防己甲素是一种从防己科植物根部提取的生物碱,近年来有研究表明汉防己甲素具有良好的抗肿瘤作用。本研究主要对汉防己甲素在体外、体内抗白血病的作用以及对其分子机制做了进一步研究。诱导细胞分化是化学药物治疗白血病的重要机制,且大量研究表明药物诱导分化与自噬相关。本研究发现:2μM汉防己甲素作用于K562、THP-1以及AML病人细胞后能够诱导细胞分化。瑞氏-姬姆萨染色、NBT还原实验、流式检测细胞表面CD14与CD11b表达、Western blot检测CD14蛋白表达都检测到细胞分化的发生。另一方面,研究表明汉防己甲素能够诱导白血病细胞自噬发生,并且具有时间及浓度梯度依赖性。Western blot检测自噬标志性蛋白LC3、吖啶橙荧光染料染自噬泡、GFP-LC3荧光点聚集实验显示汉防己甲素能够诱导血癌细胞发生自噬,ptf-LC3双荧光、LC3-II转化法检测到药物处理后细胞中自噬流的产生。自噬早期抑制剂3-MA能够抑制细胞自噬的发生进而抑制细胞分化,敲除自噬相关基因atg7后也阻断了汉防己甲素诱导细胞分化的发生。以上实验表明汉防己甲素诱导的细胞分化与自噬相关。细胞内的活性氧(Reaction oxygen species,ROS)是氧化应激反应中的重要信号分子,研究表明细胞内ROS水平变化是许多药物诱导白血病细胞分化的重要机制。对汉防己甲素诱导白血病细胞分化的分子机制进行研究,结果显示汉防己甲素能够诱导白血病细胞内ROS的累积,并且ROS的累积能够影响汉防己甲素诱导的细胞分化与细胞自噬,研究中发现使用NAC及Tiron清除ROS后能够拯救其诱导的细胞分化以及自噬。c-myc是参与细胞命运决定的重要基因,有报道称一些化疗药物可以通过抑制c-MYC表达来促进白血病细胞分化。在本研究中,通过对汉防己甲素诱导白血病细胞分化分子机制的研究发现,2 μM汉防己甲素能够抑制c-MYC表达,同时对c-myc的mRNA水平也具有一定的抑制作用,研究过程中通过外源过表达c-MYC能够拯救汉防己甲素诱导的细胞分化,而且其小分子抑制剂与汉防己甲素具有协同诱导血癌细胞分化的作用。此外,研究检测到c-MYC蛋白的变化可能位于细胞自噬的上游。为了研究汉防己甲素对正常造血细胞的作用,我们将受孕12.5天后的ICR小鼠的胚胎进行剥离,收集小鼠胚胎中的造血细胞,通过MTS、细胞凋亡检测发现2 μM汉防己甲素对正常造血细胞无杀伤作用,但检测细胞自噬发现相同浓度的汉防己甲素能够促进造血细胞自噬的发生,同时我们利用分离的人脐带血造血细胞研究也发现了相同结果。在本研究中,除了一些体外的细胞实验,我们利用THP-1 Vector、THP-1 c-MYC白血病细胞建立了裸鼠异种移植瘤模型,研究汉防己甲素在体内对白血病细胞分化的影响,以及检测c-MYC是否参与其中。通过比较肿瘤大小、瘤体的重量,结果显示汉防己甲素在动物体内也有很好抑制肿瘤作用的效果;通过分析灌胃后动物体重变化,发现25 mg/kg以及50 mg/kg的汉防己甲素对老鼠的毒性较低;免疫组化分析肿瘤中CD14和c-MYC蛋白表达,结果显示在体内汉防己甲素能够诱导血癌细胞发生分化,且与c-MYC蛋白表达紧密相关;利用MDA试剂盒检测肿瘤内MDA水平的变化,能够检测到在动物体内汉防己甲素也能促进ROS的累积;通过weasterm blot以及免疫组化检测LC3以及weastern blot检测c-MYC蛋白表达也得到了与体外实验相一致的结果。综上所述,研究表明汉防己甲素可以通过抑制c-MYC表达以及促进细胞内ROS的累积诱导细胞分化与自噬的发生。因此,研究表明汉防己甲素能够作为诱导白血病细胞分化以及自噬的诱导剂,在白血病治疗中具有潜在的应用价值。
【图文】：

临床研究,生物学,进程,治疗方案

随着研究发展，越来越多的人们认识到白血病的分型以及预后均十分复杂，逡逑所以临床上用于治疗白血病的方法也有多种多样，具体治疗方法的制定需要结合逡逑病人自身情况，通过严格检测筛选出最适合病人的治疗方案。图１．２比较详细的逡逑显示了白血病研究及治疗的相关进程。逡逑２逡逑

造血干细胞,细胞分化,细胞信号转导通路

１．１．４白血病分化治疗逡逑细胞分化是机体的一种正常生理功能，，其中人体正常造血干细胞能够向有功逡逑能的成熟血细胞分化。但是在白血病的发生发展过程中，如图１．３所示，正常造逡逑血干细胞不能够进行终末分化，导致一些具有分化能力的细胞不断增殖累积逡逑（Ｔｓｉｆｔｓｏｇｌｏｕ，邋Ｐａｐｐａｓ邋ｅｔａｌ＿邋２００３）。现阶段有研究表明，造血干细胞细胞分化受多种逡逑转录因子、生长因子以及细胞信号转导通路等共同调节，如图１．４所示，在生物逡逑体内各种细胞因子能够调控造血干细胞分化为血液中存在的多种正常细胞（Ｒｏｂｂ逡逑２００７）。逡逑ＬＥＵＫＥＭＩＡ逦＾逦Ｌｅｕｋｅｍｉｃ逡逑？邋逦？邋？逦一邋Ｖ逡逑ｒ逦Ｍａｔｕｒｅ逡逑ＬＴ－ＨＳＣ逦ＳＴ－ＨＳＣ逦？＇一＂一逡逑个逦个逦？娭邋Ｂｌｏｏｄ逡逑１逦—逦１邋Ｂｌｏｃｋａｄｅ邋ｏｆ逡逑ＨＳＣｓ逦Ｕ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋Ｊ逦Ｃｅｌｌｓ逡逑ｉｎ邋ｅａｒｌｙ逡逑ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ逡逑图１．３造血干细胞分化被抑制导致白血病的发生（Ｔｓｉｆｔｓｏｇｌｏｕ，邋Ｐａｐｐａｓ邋ｅｔａｌ．邋２００３）逡逑４逡逑
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.7

【参考文献】