Olaparib联合CBP、BKM120对三阴性乳腺癌的细胞抑制作用及其机制研究

发布时间：2020-06-06 15:18

【摘要】：研究背景及目的:三阴性乳腺癌作为乳腺癌分子分型中的一种,特点是雌激素受体、孕激素受体以及人表皮生长因子2均不发生表达。癌症基因组图谱揭示了三阴性乳腺癌这类肿瘤可能存在大量的拷贝数改变,p53突变,PI3K通路激活,以及DNA损伤修复和同源重组(HR)缺陷等。因此,传统的化疗方案在这部分分子分型的肿瘤中获益不佳,至今为止三阴性乳腺癌的治疗也依然没有标准的治疗方案,这些现状急需针对三阴性乳腺癌的更有效的靶向治疗方案的推出。Olaparib、PI3K抑制剂和卡铂(CBP)均已被证实单独应用在三阴性乳腺癌中为安全和有效的。在临床I期实验中也证实了BKM120和Olaparib可以联合使用,且不存在药物的互相作用,这种有效性在BRCA突变和BRCA未突变的患者中均观察到了临床获益。因此,我们根据这三种药物的药理机制参考临床使用方案,设计了三药联合的作用在三阴性乳腺癌细胞系的实验。本研究的主要目的在于探究三药联合使用在TNBC细胞系中对细胞生长抑制的效果,并通过相关实验进一步研究其作用机制,并为未来的动物实验和临床试验提供有力的证据。研究方法:1.利用细胞增殖实验(MTT)方法对三阴性乳腺癌细胞系CAL51、MDA-MB-231和激素受体阳性的细胞系MCF-7的细胞分别进行Olaparib、CBP、BKM120三种药物单药或三药联合两种方案处理后,得到其各自的IC50值,从而评估对细胞生长的抑制作用,并使用Calcusyn2.0软件计算三药的联合指数(combination index CI),判断三种药物联合使用是否存在药物的协同作用。2.利用平板克隆形成实验,评价Olaparib、CBP、BKM120三种药物分别以单药、双药、三药多种给药方案处理后,对于CAL51和MDA-MB-231的细胞克隆形成的抑制作用。3.利用流式细胞技术检测Olaparib、CBP、BKM120三种药物分别以单药、双药或三药处理多种药物处理后,对于CAL51和MDA-MB-231的细胞周期的影响,以明确三药联合是否对细胞周期发生作用从而达到抑制细胞生长的作用。4.采用Western blotting技术检测在Olaparib、CBP、BKM120三种药物对分别以不同浓度单药处理后,检测CAL51和MDA-MB-231的细胞中H2AX、cleaved-PARP、PADPR、ATM、Chk1和Chk2蛋白的表达,以推测其对于DNA损伤的作用。5.采用Western blotting技术检测在Olaparib、CBP、BKM120三种药物分别在单药、双药或三药不同方案处理后,对CAL51和MDA-MB-231的细胞检测其H2AX、PADPR、53BP1、p27、p21和p-ATM等蛋白的表达情况,以推测使用三药后对细胞的DNA损伤及DNA修复HR通路和NHEJ通路的影响。6.利用免疫荧光方法技术进一步了解Olaparib、CBP、BKM120三种药物分别在单药、双药或三药不同方案处理后对CAL51和MDA-MB-231的细胞的DNA损伤程度的影响,并进一步研究三药联合使用对DNA修复的HR通路和NHEJ通路的活化情况的影响。研究结果:1.当Olaparib单独使用在CAL51和MDA-MB-231细胞系中,在CAL51细胞系中其IC50为44.12(μM),在MDA-MB-231细胞系中其IC50为95.07(μM),可见Olaparib单药使用在非BRCA突变的三阴性乳腺癌细胞系中其细胞杀伤作用非常有限。当Olaparib作用在激素受体阳性的MCF-7细胞系中,其IC50为2237μM,无明显细胞生长抑制作用。2.Olaparib、CBP和BKM120三种药物联合使用后,联合指数CI值在CAL51和MDA-MB-231中中均小于1.0,且大部分数据0.8,这证明三药具有较强的协同作用。而在MCF-7细胞系中却无类似协同作用出现。3.在细胞功能学实验中,当低浓度使用Olaparib、CBP、BKM120三种药物中的单药或联合使用双药时,其抑制细胞生长的作用比较有限,而当低浓度三药联合使用时却能够有效抑制细胞克隆的形成。4.在细胞周期检测中发现,Olaparib、CBP、BKM120三药联合使用后,细胞周期阻滞作用明显增强,表现在CAL51细胞系中G2/M期细胞明显增多(20.6%),MDA-MB-231细胞系中的S期细胞明显增多(10.1%)。两种细胞系在三药作用后处于G0/G1期的细胞比例较对照组均明显减少。而当比较OLA+CBP双药组和三药组时,由于BKM120的加入,G1期细胞比例明显增加。5.采用Western blotting技术检测发现,Olaparib、CBP、BKM120单药处理CAL51和MDA-MB-231两个细胞系后,H2AX,p-CHK1和p-CHK2的表达均明显增多,PADPR的表达均明显降低,证明三种药物处理后DNA损伤的相关蛋白表达明显增多,三药均具有导致肿瘤细胞DNA损伤的作用,且随药物剂量的增加,DNA损伤更为明显。6.在Olaparib、CBP、BKM120三药联合使用后,除了DNA损伤增加以外,NHEJ修复通路的蛋白53BP1,p53和p-ATM表达也明显增加,进而证明了三药的联合使用导致了NHEJ修复通路活化的增加。三药组与OLA+CBP双药组相比,p27和p21表达明显增加,反应了BKM120的加入增加了对PI3K通路的抑制作用,激活了细胞周期的G1期阻滞。7.通过免疫荧光实验,Olaparib、CBP、BKM120三药联合使用与对照组相比,γ-H2AX荧光表达明显增加,说明三药使用增加了细胞的DNA损伤,而导致代表了HR通路的DNA修复的RAD51和HR修复通路中的重要成分BRCA1的荧光表达较较双药组明显降低,53BP1的表达却明显升高。从而证明双链DNA损伤增加,但HR修复途径被抑制,导致NHEJ修复途径增多,可能造成DNA损伤修复的正确率下降,从而导致肿瘤细胞死亡。研究结论:本研究发现并证实了Olaparib、CBP、BKM120三药联合使用的有效性。三药联合使用通过DNA损伤协同作用于三阴性乳腺癌细胞,抑制同源重组修复(HR)途径,增加其非同源末端连接(NHEJ)通路进行DNA修复,从而导致DNA损伤增加、修复能力下降,最终增强其对三阴性乳腺癌细胞的杀伤作用。本研究为Olaparib联合CBP和BKM120的治疗应用提供了强有力的理论基础。
【图文】：

三阴,杀伤作用

24A-1C Olaparib 单独使用在三阴性乳腺癌细胞 CAL51 和 MDA-M杀伤作用非常有限。用 MTT 法测定三阴性乳腺癌细胞 MDA-ML51 细胞，以及 MCF-7（非三阴性乳腺癌细胞系）的半抑制浓度(A)OLA，(B)CBP，或(C)BKM120。OLA：Olaparib；CBP：卡P-BKM120；Cell inhibition(%)：细胞抑制率(%)；IC50，半抑制浓

联合应用,细胞系,卡铂,数据

C 为 CAL51、MDA-MB-231、MCF-7 三种细胞系使用三药联合应用结果。结果为三次独立实验的结果计算其平均值±标准差。*P<0.a代表单药的敏感曲线显示在图 1A-C;b代表三药联合使用后的敏感 2A-C. BKM120：NVP-BKM120; CBP：卡铂; IC50：半抑制浓度。e IC50(μM)Drug aloneaIC50(μM)Drug combinationbOlaparib CBP BKM120 Olaparib CBP BKM 44.1 1.2 4.8 3.3 0.8 0.6MB-231 95.1 16.5 11.1 12.5 3.1 2.5表格 1
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

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