MEG8-DMR对人肝癌Huh7细胞生物学行为的影响
发布时间：2020-06-08 11:46
【摘要】：DLK1-DIO3印记簇位于人类染色体14q32,包含DLK1、RTL1和DIO3这三个父源表达的蛋白质编码基因,和几个大小不一的母源表达的非编码RNA。在这些非编码RNA的基因区间内和内含子中,存在大量的C/Dsno RNAs和micro RNAs。父本甲基化的IG-DMR和Gtl2/MEG3-DMR是该印记簇内起主要调控作用的两个差异甲基化区域,先前研究显示这两个DMR区域的亲本特异性敲除会对区间内的基因表达及胚胎发育产生广泛的影响。MEG8-DMR为DLK1-DIO3印记簇内新发现的母本差异甲基化区域,位于MEG8的第二个内含子中。腺病毒载体和SB转座子系统在小鼠Meg8-DMR附近的整合插入效应,导致了上下游基因表达的异常,使小鼠肝癌的发生率增高。这暗示MEG8-DMR可能作为一种重要的DNA调控序列,对上下游基因的表达和原发性肝癌发生存在相应的调控作用。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在人源肝癌Huh7细胞系中敲除MEG8-DMR,研究MEG8-DMR对相关基因的表达变化和Huh7细胞生物学行为的影响。我们构建Cas9-MEG8-DMR重组载体并瞬时转染Huh7细胞,结果显示其可在细胞基因组水平有效敲除MEG8-DMR。敲除MEG8-DMR后在m RNA水平上,DLK1、DIO3、IGF2的表达水平下调;MEG3、MEG8的表达水平无明显变化,MEG9的表达水平上调;同样mi R-370的表达水平发生上调。MEG8-DMR的敲除使细胞增殖能力和克隆形成能力减弱,并促进了细胞凋亡;细胞形态、细胞迁移侵袭能力、细胞周期并没有发生显著性变化。综上所述,MEG8-DMR对于相关基因的表达具有调控作用,并以此影响Huh7细胞的生物学行为。这些结果对于进一步探究MEG8-DMR的调控功能和调控机制具有重要意义。
【图文】：
.4 DLK1-DIO3 印记区域介绍.4.1 DLK1-DIO3 印记区域概述基因组印记作为一种表观遗传现象，其独特性在生长发育过程中具有十分的作用。事实上，许多印迹基因都已被证明在胚胎和癌症发生中起作用[34]。，继承父母双亲的印迹等位基因对于正常的发育是必不可少的。DLK1-DIO3印记区域位于在小鼠染色体12qF1、人类染色体14q32.1-32.31，因组区域的长度约为1Mb；该印记区间包含三种蛋白质编码基因DLK1/PEGL1/PEG11和DIO3（小鼠中表示为Dlk1/Peg9，Rt11/Peg11和Dio3）,它们都是表达的基因，，参与细胞生长和并在胚胎组织中高度表达；此外，还包含有几非编码RNA(lncRNA)基因：GTL2/MEG3、MEG8和MEG9 (小鼠中表示tl2/Meg3、Rian/Irm/Meg8、Mirg/Meg9)。这些母系非编码RNA大多是为大型多子转录本的一部分；但AK050713、AK053394在人类未发现同系物。在这些lncR因间区域内分布着大量的C/D snoRNAs和miRNAs。RTL1和DIO3都存在表达反 录 物 ， 抗 PEG11/antiRTL1 和 DIO3OS （ 小 鼠 中 表 示 为 antiRtl1/Peg11io3as/Dio3os）[35]。DLK1-DIO3印记区域结构示意图如图1-1所示。
有四个结合位点位于 MEG8-DMR 上下游 2 kb 序列区间内，其中位点 CBS-3 的核心基序恰好位于 MEG8-DMR 内。MEG8-DMR 的甲基潜在改变 DMR 对 CTCF 的可结合性，因此可能是区域性的绝缘作用。可能原因是 MEG8 从母亲等位基因转录的结果。 MEG8-DMR 的转录调节功能的未知反义转录物相关联，这也类似与位于人 11p15.5 印记群OT1[86]。在许多已知印记区域如 H19-ICR、KvDMR1、Rasgrf1-DMR在锌指蛋白 CTCF 的结合[87]。CTCF 锌指蛋白具有广泛的生物学功能构域的边界、启动子或增强子等位置区域高度富集[88]。在介导基因转制、X 染色体失活、调控染色体高级构象等过程中具有重要的表观遗经典的 IGF2/H19 内以等位特异性结合于 H19-ICR 上，使 IGF2 和 H1和印记状态发生变化[89,90]。究者提出串联重复序列可能调控差异甲基化区，这也是 DMR 区域的一因结构特征，串联重复序列对区间内基因印记的维持和表达也起到一。MEG8-DMR 基因组结构图如图 1-2 所示（UCSC Genome Browseb. 2009 (GRCh37/hg19) Assembly）。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;R735.7
本文编号：2703035
【图文】：
.4 DLK1-DIO3 印记区域介绍.4.1 DLK1-DIO3 印记区域概述基因组印记作为一种表观遗传现象，其独特性在生长发育过程中具有十分的作用。事实上，许多印迹基因都已被证明在胚胎和癌症发生中起作用[34]。，继承父母双亲的印迹等位基因对于正常的发育是必不可少的。DLK1-DIO3印记区域位于在小鼠染色体12qF1、人类染色体14q32.1-32.31，因组区域的长度约为1Mb；该印记区间包含三种蛋白质编码基因DLK1/PEGL1/PEG11和DIO3（小鼠中表示为Dlk1/Peg9，Rt11/Peg11和Dio3）,它们都是表达的基因，，参与细胞生长和并在胚胎组织中高度表达；此外，还包含有几非编码RNA(lncRNA)基因：GTL2/MEG3、MEG8和MEG9 (小鼠中表示tl2/Meg3、Rian/Irm/Meg8、Mirg/Meg9)。这些母系非编码RNA大多是为大型多子转录本的一部分；但AK050713、AK053394在人类未发现同系物。在这些lncR因间区域内分布着大量的C/D snoRNAs和miRNAs。RTL1和DIO3都存在表达反 录 物 ， 抗 PEG11/antiRTL1 和 DIO3OS （ 小 鼠 中 表 示 为 antiRtl1/Peg11io3as/Dio3os）[35]。DLK1-DIO3印记区域结构示意图如图1-1所示。
有四个结合位点位于 MEG8-DMR 上下游 2 kb 序列区间内，其中位点 CBS-3 的核心基序恰好位于 MEG8-DMR 内。MEG8-DMR 的甲基潜在改变 DMR 对 CTCF 的可结合性，因此可能是区域性的绝缘作用。可能原因是 MEG8 从母亲等位基因转录的结果。 MEG8-DMR 的转录调节功能的未知反义转录物相关联，这也类似与位于人 11p15.5 印记群OT1[86]。在许多已知印记区域如 H19-ICR、KvDMR1、Rasgrf1-DMR在锌指蛋白 CTCF 的结合[87]。CTCF 锌指蛋白具有广泛的生物学功能构域的边界、启动子或增强子等位置区域高度富集[88]。在介导基因转制、X 染色体失活、调控染色体高级构象等过程中具有重要的表观遗经典的 IGF2/H19 内以等位特异性结合于 H19-ICR 上，使 IGF2 和 H1和印记状态发生变化[89,90]。究者提出串联重复序列可能调控差异甲基化区，这也是 DMR 区域的一因结构特征，串联重复序列对区间内基因印记的维持和表达也起到一。MEG8-DMR 基因组结构图如图 1-2 所示（UCSC Genome Browseb. 2009 (GRCh37/hg19) Assembly）。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;R735.7
【参考文献】
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本文编号：2703035
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