新早期胃癌标志物PRDX4清除ROS促进胃癌发生发展机制的研究

发布时间：2020-06-08 11:29

【摘要】：目的:胃癌是全球发生率排第四位的癌症,也是全球癌症中引起死亡的第二大原因。为了降低胃癌的死亡率,亟需解决的问题之一是发现新的早期胃癌特异性的标志物,实现早期胃癌的诊断,达到早期手术治疗的目的,从根本上解决胃癌死亡率高的问题。本实验室前期研究发现过氧化物酶4(Peroxiredoxin 4,PRDX4)具有早期胃癌标志物的潜能。本研究的目的为:通过建立恶性转化模型及转化细胞过表达等方法,研究PRDX4在转化细胞中的作用,揭示PRDX4通过减少转化细胞中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,使细胞处在利于生长增殖的微环境中,从而促进细胞发生恶性转化,即促进胃癌发生发展的作用。方法及结果:1、GES-1转化模型的建立、转化细胞肿瘤相关细胞功能指标的检测(1)建立恶性转化细胞体系:利用N-甲基-N-亚硝基胍(N-methyl-N-vitro-Nnitrosoguanidine,MNNG)对正常胃黏膜上皮细胞GES-1分别进行0h、4h、8h、12h、16h、20h及24h的诱导转化后,培养24h。(2)观察、分析GES-1细胞形态的变化:发现随着MNNG诱导时间的延长,细胞形态由梭形、紧密排列的细胞转变为圆形、不规则形、叠层生长的细胞,证实GES-1转化模型建立成功。(3)肿瘤相关细胞功能指标的检测结果:通过划痕实验、软琼脂克隆形成实验、MTT实验结果显示,转化细胞的迁移能力、克隆形成能力及增殖能力随着MNNG诱导时间的延长均逐渐增长,其中增殖能力最强的细胞为MTC-16;说明随着诱导时间的延长,受试细胞的转化程度逐渐增加。综合以上实验结果,诱导至16h时的转化细胞(Malignant Transformed Cell,MTC)已基本完成转化,因此选择MTC-16细胞为后续过表达质粒转染的受体细胞。2、不同诱导时间转化细胞中ROS含量的检测,证实ROS促进胃癌的发生利用DCFH-DA荧光探针法检测诱导不同时间的细胞ROS含量,对比相同培养时间的GES-1细胞ROS含量结果显示:随着诱导时间的延长,转化细胞中的荧光强度呈现先上升后下降的趋势;当诱导0-12h时,转化细胞荧光强度逐渐上升,当诱导至12h-16h时,转化细胞的荧光强度升高至51092.92?99.54,达到最高;当诱导至16h-24h时,转化细胞的荧光强度略有下降,分别为49652.14?429.15和47558.16?956.53,且不同诱导时间的各组转化细胞的荧光强度值均显著高于GES-1细胞(42231.99?1064.91)。结果表明,随着诱导时间的延长ROS能够促进细胞的转化过程,当细胞基本转化后(诱导16h以后),随着转化程度进一步增加,ROS含量逐渐下降,避免转化细胞发生凋亡,从而为肿瘤细胞的生长、增殖提供一个良好的微环境。3、诱导不同时间细胞中PRDX4含量的检测,证实PRDX4促进胃癌发生发展的作用利用RT-PCR、Western Blot及ELISA方法检测各受试细胞中PRDX4 m RNA及蛋白的表达量,结果显示,诱导0-12h时,PRDX4含量并无较大变化(GES-1细胞中为2.70?0.47ng/m L);诱导12h-16h时,细胞中PRDX4表达量升高达到3.51?0.08ng/m L;诱导16h-24h时,细胞中的PRDX4含量逐渐下降。该结果表明,PRDX4在0-12h时未及时清除细胞中的ROS,成为导致细胞内ROS急剧升高的原因之一,从而间接的促进了细胞发生转化,即促进了胃癌的发生过程;诱导16h-24h时,PRDX4含量升高,清除了细胞中的ROS,使得细胞处于利于转化细胞生长、增殖的微环境中,从而促进细胞恶性转化,即促进了胃癌的发展过程。4、PRDX4过表达的MTC-16细胞体系的建立,验证PRDX4促进肿瘤发展的作用(1)PRDX4过表达的MTC-16细胞体系的建立:利用脂质体瞬时转染法,将重组构建的过表达载体GV230-PRDX4转染到MTC-16细胞中,通过荧光显微镜观察转染效率;确认转染成功的基础上,利用Western Blot法验证PRDX4过表达体系中的PRDX4蛋白含量,证实PRDX4过表达体系建立成功。(2)肿瘤相关细胞功能指标检测结果:MTC-16-GV230-PRDX4组的迁移能力、克隆形成能力及增殖能力明显高于MTC-16组及GES-1组,证实PRDX4能够促进完成转化的细胞,转化程度进一步加深,即促进胃癌的发展过程。5、PRDX4过表达的MTC-16细胞体系中ROS含量及PRDX4蛋白含量的检测,验证PRDX4在细胞中促癌作用的机制(1)ELISA检测GES-1、MTC-16、MTC-16-GV230及MTC-16-PRDX4细胞中PRDX4蛋白含量,结果显示:MTC-16-PRDX4细胞中PRDX4蛋白浓度为3.75?0.08ng/m L,显著高于GES-1(2.20?0.12ng/m L)、MTC-16(3.14?0.06ng/m L)和MTC-16-GV230(3.05?0.08ng/m L)细胞。(2)利用DCFH-DA荧光探针法检测GES-1、MTC-16、MTC-16-GV230及MTC-16-PRDX4细胞中ROS的含量,结果表明:MTC-16-PRDX4组中ROS含量为(45271.78?1736.2)显著低于只转染了空载体的早期胃癌模型细胞(51092.92?810.99),进一步证实PRDX4通过清除ROS,使得细胞处在利于生长增殖的微环境中,防止细胞凋亡,从而起到促进胃癌发生发展的作用。结论:1、随着诱导时间的增长,转化细胞的各项肿瘤相关细胞功能指标(迁移能力、克隆形成能力及增殖能力)均有升高,诱导16h的转化细胞(MTC-16)已基本完成转化。2、PRDX4在细胞初步转化阶段,未能及时清除ROS,从而间接促进了胃癌的发生;PRDX4在细胞基本完成转化后,通过清除转化细胞中的ROS,防止细胞由于ROS水平过高发生凋亡,使得转化细胞处于利于细胞生长增殖的微环境中,从而促进胃癌的发展。
【图文】：

晶体结构模型,肿瘤

图 1-1 PRDX4 十聚体晶体结构模型[38]Figure1-1 PRDX4 decamer crystal structure model[38]的国内外研究中，，多数研究者已经探究了 PRDX4 与其他出 PRDX4 在各类肿瘤中多数为促癌作用（表 1-1）。

新早期胃癌标志物PRDX4清除ROS促进胃癌发生发展机制的研究

细胞中ROS的平衡[53]
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

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