基于LncRNA的食管鳞癌干细胞放射敏感性研究

发布时间：2020-06-10 11:36

【摘要】：目的筛选出与食管鳞癌干细胞放射敏感性相关的LncRNA。方法对人食管鳞癌细胞株Eca109进行无血清培养形成富集干细胞的悬浮细胞球(瘤球细胞组)和正常血清培养形成的细胞(贴壁细胞组)。分别通过CCK8细胞增殖实验和克隆形成等实验初步确定瘤球细胞是否具有干细胞特性。验证CD44是否为食管鳞癌干细胞标志物。通过流式分选技术从瘤球细胞组中分选出CD44+食管鳞癌干细胞,从贴壁细胞组中分选出CD44-食管鳞癌细胞,再用LncRNA高通量测序分析CD44+食管鳞癌干细胞与CD44-食管鳞癌细胞细胞间的LncRNA差异表达谱,并应用Real-time PCR方法验证筛选与食管鳞癌干细胞放射敏感性相关的特异性LncRNA。结果1.人食管鳞癌干细胞的细胞球(瘤球细胞)培养条件的摸索及确定:结果显示使用1×10~5个/ml密度进行培养所获得瘤球细胞生长状态良好。2.细胞增殖实验结果显示:细胞培养24h、48h、72h后瘤球细胞组的吸光度值较贴壁细胞组均明显的升高,差异具有统计学意义(P0.05)。瘤球细胞组细胞克隆形成率较贴壁细胞组高,差异具有统计学意义(P0.05)。3.克隆形成实验结果显示:根据放射敏感性参数分析,与贴壁细胞组比较,瘤球细胞组的D0、Dq、N和SF2值明显升高,放射增敏比为1.556。4.流式细胞仪检测CD44结果显示:瘤球细胞组CD44的表达率和量均较贴壁细胞组高,差异具有统计学意义(P0.05)。5.LncRNA高通量测序分析结果显示:流式分选技术分选出的CD44+食管鳞癌干细胞与CD44-食管鳞癌细胞,采用LncRNA高通量测序分析,并选取|log2Ratio|≥1和q0.05的基因作为显著差异表达筛选条件,筛得4961个基因在两组细胞中表达呈显著差异,与CD44-食管鳞癌细胞相比,CD44+食管鳞癌干细胞组2517个基因表达显著上调;2444个基因显著下调,其中mRNA3129个,1479,上调,1695个下调;lncRNA1832个,1038个上调,794个下调。6.Realtime PCR结果显示:选择前10位差异性表达最大的LncRNA基因(其中CH17-360D5.2、CH17-360D5.3、AC113607.2、RP11-439E19.10、MSTRG.424、MSTRG.64087、MSTRG.116589、MSTRG.15903上调,RP13-895J2.7、MSTRG.73085下调)进行验证,结果显示:MSTRG.73085表达下调,其平均表达水平约为20.7倍(LncRNA高通量测序分析为49.3倍),CH17-360D5.2、RP11-439E19.10、MSTRG.424、MSTRG.64087、MSTRG.15903表达上调,其平均表达水平分别为2.7、8.7、3.7、5、7倍(LncRNA高通量测序分析分别为8.2、5.2、78.9、3、4.7倍)。结论1.人食管鳞癌细胞株Eca109无血清培养能够获得悬浮的富集人食管鳞癌干细胞的细胞球,CD44可能是人食管鳞癌干细胞的标志物。2.应用LncRNA高通量测序结合Realtime PCR技术验证筛查差异表达基因,与贴壁细胞组相比,其中MSTRG.73085在瘤球细胞组中表达显著下调,CH17-360D5.2、RP11-439E19.10、MSTRG.424、MSTRG.64087、MSTRG.15903表达显著上调,这些差异性LncRNA基因有可能与食管鳞癌干细胞的放射敏感性相关,有望成为食管鳞癌潜在的药物治疗新靶点和指导食管鳞癌的个体化放射治疗。
【图文】：

生长曲线,球细胞,生长情况,贴壁细胞

长情况如图 1-3 所示，结果显示使用 1×105个/ml 密度进行培养所获得瘤长状态良好，选择该密度进行瘤球细胞的大量培养。Eca109 贴壁细胞和瘤球细胞的生长曲线正常培养的贴壁生长的 Eca109 细胞为贴壁细胞，分别测定 Eca109 贴壁球细胞在 0h，24h，，48h，72h 细胞活性，绘制瘤球与贴壁细胞生长曲线胞活性均高于贴壁细胞（P<0.05，图 4，表 1）。表 1 Eca109 贴壁细胞与瘤球细胞的增殖情况对比别 0 24h 48h 72h细胞 0.1751±0.01382 0.4358±0.01831 0.7686±0.06916 1.460±0.0细胞 0.1430±0.01744 0.5703±0.04437 1.096±0.05481 1.698±0.0P 0.0271 0.0008 0.0005 0.004

球细胞,生长情况

瘤球细胞生长情况（×200，1×106个/ml）
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1

【参考文献】