组蛋白甲基转移酶KMT2C与慢性粒细胞白血病BCR-ABL1非依赖性耐药的关系及机制研究

发布时间：2020-06-10 16:24

【摘要】：慢性粒细胞白血病(CML)是慢性白血病中最常见的一种类型,约占成人白血病的15%。在全球范围内,慢性粒细胞性白血病的发病率为1～2/10万,在中国约为0.36～1/10万,以中老年人为主。BCR-ABL1蛋白的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)-伊马替尼(IM)的出现,彻底改变了 CML的治疗方式,使CML患者每年的相关死亡率从10～20%降到了 1～2%,10年生存期也由10～20%提高到80～90%。TKI药物的不断出现,为维持CML患者的长期缓解状态带来了美好的前景。IM使CML从一种致命的恶性疾病变成了一种慢性疾病。然而,约20～40%新诊断的CML慢性期患者,最终因为药物的不良反应或耐药需要更换治疗方式。耐药的主要原因可分为BCR-ABL1酪氨酸激酶依赖性耐药和非依赖性耐药,依赖性耐药主要与]00多种酪氨酸激酶区突变相关。而在非依赖性耐药中,虽然TKI药物成功抑制了 BCR-ABL1激酶的活性,但是旁路信号通路的激活,弥补了酪氨酸激酶活性的损失,可促使CML细胞持续增殖,凋亡下调,最终导致TKI耐药。然而,引起BCR-ABL1非依赖性耐药的相关机制尚未明确。鉴于上述原因,本研究针对CML患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药,通过临床病例信息、骨髓/外周血样本检测和体外细胞模型构建等方式,利用高通量测序以及CRISPR/Cas9基因编辑等实验技术,初步探讨了 BCR-ABL1非依赖性耐药相关的异常基因、信号通路及耐药机制。第一部分慢性粒细胞白血病早期分子学反应与伊马替尼耐药的临床研究目的探讨CML-CP患者早期分子学反应与IM耐药之间的关系。方法1.采用Sanger法测序,检测IM耐药患者的BCR-ABL1激酶区突变情况,明确其耐药类型;2.分析早期分子学反应与IM治疗、耐药的关系;3.统计学处理:年龄和时间等变量采用中位数描述,不同组间分类资料的比较采用χ2检验,两样本定量资料的比较采用方差齐性检验和独立样本t检验,P0.05为差异具有统计学意义,采用SPSS 20.0进行统计分析。结果1.198例未检出激酶区突变的IM耐药患者,早期服用羟基脲、马利兰或干扰素作为初始治疗药物的比例较高(43%),且非IM药物使用时间越长,后期出现无激酶区突变的耐药患者比例越高;2.初始使用非1M药物的时间越长,患者BCR-ABL13mon10%的风险越高,IM耐药时无激酶区突变的比例越高;3.当BCR—ABL13mon≤10%,BCR-ABL16mon1%的患者中,耐药发生时检出激酶区突变的比例较高。结论1.CML患者IM治疗前,干扰素和羟基脲、马利兰等细胞毒药物的使用,可能会造成患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药;2.BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药,可能会导致CML患者3个月时的分子学反应较差,但不影响IM出现耐药的时间:3.CML患者6个月时BCR-ABLl水平升高,提示可能出现BCR-ABL1激酶区突变导致的继发耐药。第二部分高通量测序技术筛选慢性粒细胞白血病BCR-ABL1非依赖耐药相关基因目的高通量测序技术筛选CML患者中BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药相关的异常基因。方法1.采用高通量测序技术,以口腔粘膜为对照,筛选BCR-ABL1非依赖性耐药相关基因;2.采用Sanger法测序,验证347例CML耐药患者中相关基因突变频率;3.检测相关基因表达水平,进一步分析可能存在的耐药原因;4.统计学处理:数据用均数±标准差描述,不同组间分类资料的比较采用χ2检验,两样本定量资料的比较采用方差齐性检验和独立样本t检验,P0.05为差异具有统计学意义,采用SPSS 20.0进行统计分析。结果1.19例无BCR-ABL1激酶区突变的IM耐药患者,采用高通量测序技术筛查578个肿瘤相关基因,筛选结果提示,KMT2CK339N和RUNX1 H214P可能与BCR-ABL1非依赖性耐药相关;2.无激酶区突变的198例CMLIM耐药患者中,检出25例KMT2CK339N突变,其突变频率明显高于携带激酶区突变的耐药患者,而RUNX1 H214P在二组间的突变频率较低,且无明显差异;3.KMT2C mRNA表达水平与IM耐药类型及KMT2C K339N突变无相关性。结论1.KMT2C K339N不伴随KMT2C mRNA表达水平的改变,提示K339N点突变可能造成KMT2C蛋白功能学上的异常;2.KMT2C K339N可能激活相关旁路信号通路,导致CML患者BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药。第三部分KMT2C调控H3K4单甲基化与慢性粒细胞白血病BCR-ABL1非依赖耐药的机制研究目的进一步明确KMT2CK339N点突变与BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药的关系及机制。方法1.采用Western Blot法,分析在CML中,KMT2CK339N与不同H3K4甲基化修饰间的关系;2.通过 Real-time RT-PCR 和 Western Blot 法,分析 KMT2C K339N 与PI3K/AKT信号通路间的关系;3.统计学处理:数据用均数±标准差描述,两样本定量资料的比较采用方差齐性检验和独立样本t检验,P0.05为差异具有统计学意义,采用SPSS 20.0进行统计分析。结果1.H3K4甲基化水平分析,MT2CK339N患者的H3K4mel水平明显低于KMT2CWT患者,而H3K4me2和H3K4me3在二者间均没有明显差异;2.KMT2CK339N患者中PTEN和P21的水平均明显下降,AKT Thr308、AKT Ser473 和 XIAP 的水平明显升高,而 PI3K p110α AKT、BCL-2、BAX 和 P27的表达水平均与KMT2CWT患者没有明显差异。结论1.KMT2C K339N可能通过下调H3K4mel水平来激活旁路信号通路,引起BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药;2.H3K4mel下调可能通过抑制PTEN表达,进而磷酸化AKT,调节细胞周期抑制蛋白P21和凋亡抑制蛋白XIAP的表达水平,最终影响CML细胞的非依赖性耐药。第四部分CRISPR/Cas9构建KMT2CK339N K562细胞模型及相关机制研究目的构建KMT2CK339N K562细胞模型,进一步明确相关机制。方法1.采用CRISPR/Cas9结合ssODN,构建KMT2CK339N K562细胞模型;2.使用CCK8细胞增殖实验、EdU细胞增殖实验和甲基纤维素克隆形成实验,进一步明确KMT2CK339N K562的细胞增殖情况;3.使用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡实验,进一步明确KMT2CK339N K562的细胞凋亡情况;4.采用 Real-time RT-PCR 和 Western Blot 法,进一步明确KMT2C K339N突变与H3K4单甲基化及P13K/AKT信号通路的关系;5.统计学处理:数据用均数±标准差描述,两样本定量资料的比较采用方差齐性检验和独立样本t检验,P0.05为差异具有统计学意义,采用SPSS 20.0进行统计分析。结果1.使用CRISPR/Cas9,结合ssODN,将K562细胞定点敲入KMT2CK339N点突变,构建KMT2CK339N K562细胞模型;2.KMT2CK339NK562细胞增殖能力提高,而凋亡水平下降;3.KMT2CK339N K562细胞的H3K4的单甲基化水平下降,而PTEN、P21、BCL-2、BAX 和 P27 的水平均明显下降,AKTThr308、AKT Ser473 和XIAP 的水平明显升高,而PI3K p110α和AKT的表达水平无明显变化。结论KMT2C K339N突变可影响自身组蛋白甲基转移酶功能,下调H3K4me1水平,进而抑制P13K/AKT信号通路中负性调节因子PTEN的表达,上调AKT的磷酸化水平,影响CML细胞的凋亡和增殖,最终导致CML患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药。
【图文】：

早期评价,耐药,信号通路,早期治疗

Ｃｈｒｏｍｅ邋Ｐｈａｓｅ，邋ＣＰ）患者服用伊马替尼，可以达到分子学缓解［２Ｕ。然而，约２０？４０％新诊断的ＣＭＬ－Ｃ反应或耐药需要更换治疗方式［２２＿２７］。耐药的主要激酶依赖性耐药和非依赖性耐药。在ＢＣＲ－ＡＢＬ１发现超过１００多种ＡＢＬ激酶区突变与伊马替尼耐代ＴＫＩ耐药相关，其主要集中于能够结合三磷酸合位点和负责催化的Ａ环（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋Ｌｏｏｐ）等［成的伊马替尼耐药仅占全部耐药的３０？４０％［３？３３］。激酶非依赖性耐药中，ＴＫＩ药物成功抑制了邋ＢＣＲ－信号通路的激活，例如：ＳＲＣ、ＰＩ３Ｋ、ＫＲＡＳ和ＪＡ性的损失，可导致ＣＭＬ细胞的持续增殖［３４＿３８］（图１．信号旁路激活的相关研究较少，其机制尚未明确。影响了邋ＣＭＬ患者远期的疗效评估和治疗方式的选激酶非依赖性耐药的早期评价对于ＣＭＬ初始ＴＫＩＭＬ治疗方式的选择具有重要的临床价值。逡逑

类型,耐药,患者,位点

第一部分慢性粒细胞白血病早期分子学反应与伊马替尼耐药的临床研宄逡逑没有发现突变。已检出的突变包含在激酶区２２个位点上的３８种突变类型，其逡逑中Ｐ环突变（位点２４４－２５５）邋５８例（３９％），ＩＭ结合位置突变（位点３１５和３１７）逡逑４５例（３０％），催化结构域内突变（位点３５０－３６３）邋４０例（２７％），活化环（Ａ－ｌｏｏｐ）逡逑突变（位点３８１－４０２）邋６例（３％）。突变频率较高的位点和类型依次为Ｔ３１５Ｉ邋（３４，逡逑２３％），Ｅ２５５Ｋ／Ｖ邋（２８，１９％），Ｆ３５９Ｃ／Ｖ／Ｉ邋（２１，１４％），Ｍ２４４Ｖ邋（１５，１０％），逡逑Ｍ３５１ＴＡ＾（１６，邋１１％），邋Ｙ２５３Ｆ／Ｈ（１３，邋９％），邋Ｆ３１７ＬＣ１０，邋７％），邋Ｇ２５０Ｅ邋（９，邋６％），逡逑Ｑ２５２Ｈ邋（９，邋６％）等，其中复合突变２６例（１９％）（图１．２）。逡逑１９８例ＩＭ耐药患者并未检出突变，根据其相关影响因素及治疗过程进行对逡逑比分析（表１．２）。发现无突变ＩＭ耐药患者中，女性患者比例较高，且患者年龄逡逑较大。所有发生ＩＭ耐药的患者中，有１３１例（３８％）患者确诊后，因各种因素逡逑选择羟基脲、马利兰或干扰素作为初始治疗药物，而这部分患者在未检出突变逡逑的耐药患者中比例较高（４３％邋ｗ．３１％），且随着非Ｍ药物使用时间越长，此类逡逑患者比例越高。而在出现激酶区突变的耐药患者中，初始直接使用Ｍ的患者较逡逑多（６９％）。针对发生激酶区突变的耐药患者与无突变的耐药患者，二者的！ｍ耐逡逑药时间无明显差异。逡逑
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.72

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