展示VEGFR2的重组T4噬菌体抑制VEGF诱导的血管生成及肿瘤生长

发布时间：2020-06-10 16:25

【摘要】：背景肿瘤的发生、发展是多种促癌因素协同作用的结果。肿瘤的生长、侵袭和转移均依赖于血管生成(Angiogenesis)。肿瘤血管生成的过程受多种促血管生成因子和抗血管生成因子调控。VEGF是目前已知的肿瘤血管生成过程中最重要的促血管生成因子。其主要通过结合血管内皮细胞膜上的VEGF受体(VEGFR)发挥其生物学功能,其中VEGFR2是VEGF的主要功能受体。VEGFR2在其胞内结构域中含有多个酪氨酸磷酸化位点,这些位点活化以后可以调节VEGF介导的血管内皮细胞的存活、增殖和迁移。VEGF/VEGFR2信号转导通路在肿瘤血管生成中起关键作用。因此,阻断VEGF/VEGFR2信号转导通路可抑制肿瘤发展。T4噬菌体表面展示技术是利用T4噬菌体表面的两种非必需外壳蛋白(SOC和HOC)在噬菌体表面展示外源蛋白的蛋白表达系统。与M13、λ和T7噬菌体相比,T4噬菌体含有更大的基因组,因此它可以展示更大分子量的外源蛋白。外源蛋白通过与SOC或HOC融合而在T4噬菌体表面展示,同时保持相对独立的结构和生物学活性。目前,T4噬菌体展示技术主要用于疫苗的设计、肽文库构建和蛋白质-蛋白质相互作用的研究。如人类免疫缺陷病毒(HIV)、口蹄疫病毒(FMDV)和猪瘟病毒(CSFV)的疫苗的研发。在本研究中,我们构建了展示VEGFR2胞外结构域的T4重组噬菌体(T4-VEGFR2),研究其抗血管生成活性。通过建立Lewis肺癌(LLC)和结肠癌(CC)小鼠模型,研究T4-VEGFR2重组噬菌体在抑制肿瘤生长、转移中的作用。目的构建表面展示VEGFR2胞外区结构域的T4-VEGFR2重组噬菌体,利用体外和体内实验研究其抗肿瘤血管生成能力,为进一步临床实验提供科学依据。方法1.合成人VEGFR2(hVEGFR2)和小鼠VEGFR2(mVEGFR2)的胞外区片段核酸编码序列。利用PCR对含有不同长度结构域的mVEGFR2和hVEGFR2基因片段进行扩增,然后将扩增片段连接到pJKS质粒上,构建pJKS-VEGFR2重组质粒。2.将pJKS-VEGFR2重组质粒转化入大肠杆菌BL21化学感受态细胞。然后将含有重组质粒的大肠杆菌BL21接种感染复数为0.5的T4-e~-噬菌体,使T4噬菌体与pJKS-VEGFR2质粒进行同源重组,构建T4-VEGFR2重组噬菌体。3.使用双层琼脂法扩增来自单个噬菌斑的候选T4-VEGFR2重组噬菌体,利用噬菌斑PCR和流式细胞术鉴定筛选T4-VEGFR2重组噬菌体。4.利用酶联免疫吸附-噬菌体滴定(ELISA-titer)试验和噬菌体-酶联免疫吸附试验(phage-ELISA)检测T4-VEGFR2重组噬菌体与VEGF的结合能力。野生型T4噬菌体(T4-W)在实验中作为对照。5.利用MTT和Trans-well试验研究T4-VEGFR2重组噬菌体对VEGF诱导的血管内皮细胞增殖和迁移的抑制作用。利用磷酸化特异性流式细胞术(Phospho-specific Flow cytometry)分析T4-VEGFR2重组噬菌体对VEGF诱导VEGFR2及其下游信号的磷酸化的作用。6.建立Lewis肺癌(LLC)和结肠癌(CC)小鼠皮下移植瘤模型,随机分成T4-VEGFR2重组噬菌体治疗组、野生噬菌体T4治疗组和PBS治疗组,通过测量在体肿瘤体积及观察荷瘤小鼠生存期,分析T4-VEGFR2重组噬菌体的体内抗肿瘤能力;对肿瘤组织中微血管进行免疫组织化学染色,分析T4-VEGFR2重组噬菌体的体内抗血管生成能力。结果1.成功构建T4-VEGFR2重组噬菌体,经噬菌斑PCR、流式细胞术鉴定发现,VEGFR2基因片段成功插入T4噬菌体基因组,VEGFR2蛋白成功表达并且展示于T4噬菌体的表面。2.ELISA-Titer和phage-ELISA试验证实T4-VEGFR2重组噬菌体可以特异性结合VEGF,T4-VEGFR2-1-7噬菌体与VEGF结合能力最强。3.T4-VEGFR2重组噬菌体可以抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖和迁移。4.T4-VEGFR2重组噬菌体可以抑制VEGF诱导的VEGFR2及其下游信号磷酸化。5.T4-VEGFR2重组噬菌体能够抑制小鼠在体移植瘤生长并延长荷瘤小鼠的存活时间。6.T4-VEGFR2重组噬菌体能够降低小鼠移植瘤微血管密度(MVD)。结论T4-VEGFR2重组噬菌体能够抑制VEGF介导的肿瘤血管生成,抑制肿瘤进展,为抗肿瘤血管生成治疗提供一种新的方法。
【图文】：

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4实验结果4 实验结果4.1 VEGFR2 胞外结构域在 T4 噬菌体表面的展示为了直观的显示T4噬菌体展示VEGFR2的原理，我们绘制了T4-VEGFR2重组体的构建模式图(图1)。首先，将携带编码VEGFR2胞外区不同长度的基因片段与质粒连接，，然后将重组质粒转化到大肠杆菌宿主细胞中以进行同源重组并整合到菌体基因组中。在T4噬菌体繁殖的过程中，整合到噬菌体基因组的VEGFR2基因经过表达和包装，以VEGFR2-SOC融合蛋白的形式自动的展示在T4噬菌体表面

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所有的噬菌体都显示出预期分子量大小的条带（图2A和2B）。图 2 利用噬菌斑 PCR 技术鉴定 T4-VEGFR2 重组噬菌体注：A 为 PCR 鉴定 T4-mVEGFR2 重组噬菌体；B 为 PCR 鉴定 T4-hVEGFR2 重组噬菌体。为了验证VEGFR2蛋白是否已经成功展示于噬菌体的表面，我们将噬菌斑包被于磁珠上，然后使用流式细胞术检测VEGFR2蛋白的表达。如图3A和3B所示，除T4-W噬菌体外，T4-mVEGFR2-1-4、T4-mVEGFR2-1-5、T4-mVEGFR2-1-6、T4-mVEGFR2-1-7和T4-hVEGFR2-1-4、T4-hVEGFR2-1-5、T4-hVEGFR2-1-6及T4-hVEGFR2-1-7噬菌体均表达相应的VEGFR2蛋白。以上结果说明，VEGFR2基因成功插入T4噬菌体的基因组，并且成功展示于T4噬菌体的表面。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.2

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