巴弗洛霉素A1特异性杀伤急性B淋巴白血病干细胞作用初步研究

发布时间：2020-06-10 20:03

【摘要】：目的:本文旨在探究巴弗洛霉素A1(BafilomycinAl,简称Baf-Al)是否可以特异性杀伤人急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphocytic leukemia,B-ALL)干细胞。方法:(1)收集B-ALL患者骨髓样本及健康人骨髓(NBM)样本,用Baf-Al处理原代B-ALL单个核细胞及正常骨髓单个核细胞,利用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)分析B-ALL患者骨髓单个核细胞与正常骨髓单个核细胞中CD34+以及CD34+CD19+细胞比例的变化。(2)收集B-ALL患者骨髓样本及健康人骨髓样本,通过流式细胞分选仪(Fluorescence-activated cell sorter,FACS)分选出 B-ALL CD34+CD19+细胞以及NBM CD34+细胞,在不同浓度Baf-Al处理以及不同Baf-Al处理时间的条件下,研究Baf-Al对B-ALL干细胞增殖的影响。(3)收集B-ALL患者骨髓样本及健康人骨髓样本,通过流式细胞仪分选出B-ALLCD34+CD19+细胞以及 NBMCD34+细胞。采用 Annexin V-FITC/PI 双染色法分析B-ALL干细胞以及正常造血干细胞在不同浓度Baf-Al处理以及不同Baf-Al处理时间条件下细胞凋亡情况。(4)收集B-ALL患者骨髓样本,通过流式细胞仪分选出B-ALLCD34+CD19+细胞,Baf-Al处理后,利用流式细胞分析仪检测Baf-Al是否诱导B-ALLL干细胞向终末分化细胞分化。(5)利用流式细胞分选术分选出B-ALLCD34+CD19+细胞以及NBM CD34+细胞,Baf-Al处理后,运用流式细胞分析仪分析细胞周期的变化。(6)将B-ALLCD34+CD19+细胞经尾静脉注射入NSG小鼠体内,建立急性B淋巴细胞白血病小鼠模型。实验分为以下3组:对照组、模型组、治疗组。对照组小鼠注射PBS;模型组小鼠注射B-ALL。干细胞;治疗组小鼠于注射白血病干细胞7天后,腹腔注射Baf-Al治疗。统计小鼠的生存曲线,分析小鼠骨髓、外周血表达外源性白血病抗原标志(hCD45、hCD34和hCD19)的情况,检测反映小鼠生理状况和发病程度的各项指标,包括:血常规、肝脾系数、肝脾病理变化等。结果:(1)Baf-Al能显著降低原代B-ALL单个核细胞中白血病干细胞的比例,而相同剂量的Baf-Al对正常造血干细没有显著影响。(2)Baf-Al能显著抑制原代B-ALL干细胞生长,而相同剂量的Baf-Al对正常造血干细胞没有明显抑制作用。(3)Baf-Al特异性诱导原代B-ALL干细胞凋亡。(4)Baf-Al使部分原代B-ALL干细胞分化为成熟B细胞。(5)Baf-Al使部分原代B-ALL干细胞离开GO期,进入细胞周期。(6)在急性B淋巴细胞白血病小鼠模型中,生存曲线统计结果显示:对照组小鼠始终存活,模型组小鼠存活时间约为55天,治疗组小鼠存活时间约为110天。小鼠外观观察结果显示:模型组小鼠呈现弓背蜷缩、活动减少、精神萎靡的状态;而Baf-Al治疗组小鼠的状态比模型组小鼠有明显的改善。流式结果显示:模型组小鼠骨髓细胞中人CD45+、CD34+CD19+细胞比例与对照组相比明显增加;而治疗组小鼠骨髓中对应细胞的比例与模型组相比明显下降。血常规结果显示:模型组小鼠外周血中白细胞数目与对照组小鼠相比明显增加,红细胞、血小板、血红蛋白数目明显下降;而在治疗组小鼠外周血中,Baf-Al治疗可以恢复白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板的正常数目。肝脾病理检查结果显示:模型组小鼠的肝脾肿大明显,肝脏中有大量白血病细胞浸润;而治疗组小鼠的肝脾肿大情况有所恢复,肝脏白细胞浸润现象明显减轻。结论:(1)Baf-Al能够特异地抑制B-ALL干细胞增殖并诱导其凋亡,而不影响正常造血干细胞。(2)体外Baf-Al处理B-ALL干细胞,能够减弱其起始白血病的能力。(3)腹腔注射Baf-Al治疗,能够有效地延长患病小鼠的存活时间,并改善患病小鼠的生存状况。
【图文】：

Ｂａｆ－Ａｌ是一种常用的自噬抑制剂，它可以抑制自噬溶酶体的形成。当我们使逡逑用Ｂａｆ－Ａｌ处理Ｂ－ＡＬＬ细胞时，意外发现：Ｂａｆ－Ａｌ可使Ｂ－ＡＬＬ患者骨髓单个核细逡逑胞中具有ＣＤ３４＋表型的细胞比例显著降低（图１）。ＣＤ３４是一个经典的干细胞标逡逑志物。因此，这个现象提示Ｂａｆ－Ａｌ可能靶向杀伤Ｂ－ＡＬＬ干细胞。那么，Ｂａｆ－Ａｌ逡逑对正常造血干细胞是否会有毒副作用呢？随后，我们又收集了邋１０例健康人骨髓样逡逑本，，分离出单个核细胞，用Ｂａｆ－Ａｌ处理后发现：健康人骨髓单个核细胞中具有逡逑ＣＤ３４＋表型的细胞比例未受影响（图１）。以上结果表明，Ｂａｆ－Ａｌ可能靶向杀伤逡逑Ｂ－ＡＬＬ干细胞，而对正常造血干细胞无毒副作用或毒副作用较小。逡逑Ｃｔｒｌ逦ＤＭＳＯ逦Ｂａｆ－Ａ１逦ＣＤ３４逡逑0邋＊＊逡逑１０００逦１０００逦１０００逦委逦＾逦ｒ￣＾ｉ逦＇逡逑２邋５０邋ｎ邋ｉ逦？逡逑８００：逦Ｉ逦８００逦８００逦－Ｊ邋＾逦？逡逑ｗ邋６００逦６００逦６００逦５逦0ｎ＇逦＼逦－１逡逑４００逦４００逦４００逦２０－邋＊：逦？？全．逡逑２００逦、逦２００逦S缅危玻埃板尉缅危殄危

本文编号：2706791