Tim-3及其多态性与乳腺癌关系的初步研究

发布时间：2020-06-10 23:11

【摘要】：[研究背景]乳腺癌是严重影响女性健康最常见的恶性肿瘤之一。近年来,中国女性乳腺癌发病率呈上升及年轻化趋势,已高居女性恶性肿瘤的第一位。尽管随着乳腺癌病因和发病机制研究、治疗方式及治疗方案的改进,乳腺癌死亡率明显降低,但是其早期诊断、疗效和预后并不乐观,肿瘤转移、复发和抵抗治疗仍然是乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌的病因及发病机制复杂,其发生是一个多因素诱导、多基因参与和多路径相互作用的复杂过程。肿瘤的发生、发展、转移与机体的免疫系统密切相关,一方面机体通过免疫系统的免疫监视和免疫清除功能识别、杀伤并清除肿瘤细胞;另一方面肿瘤细胞可以修饰自身抗原或者异常表达一些负性调控分子,改变机体肿瘤微环境并负性调控机体的抗肿瘤免疫,使肿瘤细胞逃避机体的免疫识别与攻击,从而逃避免疫监视而发生免疫逃逸。肿瘤细胞的浸润和转移是影响肿瘤患者预后的首要因素,转移过程是极其复杂的动态过程,包括癌细胞本身特性、机体免疫、内分泌、代谢与微环境等多方面因素之间相互作用。此外,机体本身的基因与遗传因素也与乳腺癌发病密切相关,乳腺癌相关遗传因素涉及多个基因,这些基因的单核苷酸多态性及其特定组合可能是造成癌症易感性最重要的原因。Tim-3作为抗肿瘤免疫的负性调节因子,是近年来肿瘤免疫研究的热点,通过其机制的研究以及与其特异性结合并抑制其表达的分子或者单克隆抗体的研制,对实现肿瘤免疫治疗有着重要的研究价值和巨大的潜力。Tim-3广泛表达于Th1细胞、细胞毒性CD8+T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞等各种免疫细胞,可在人体固有和适应性免疫应答中,通过调节细胞因子的分泌和免疫细胞的功能来调节机体的防御功能,在一系列炎症疾病和肿瘤等多种免疫相关疾病中发挥重要作用。已有研究证实,Tim-3并不局限于在各种免疫细胞表达,也异位表达在一系列的正常的和恶性的组织中,在促进肿瘤侵袭、转移过程中发挥重要作用,并且其表达与患者预后不良相关。然而,Tim-3与乳腺癌之间的关系知之甚少。在本研究中,我们首先探讨Tim-3基因单核苷酸多态性与乳腺癌易感性和预后之间的关联,从而筛选与乳腺癌易感性相关的多态性位点或者等位基因,为探索乳腺癌易感的遗传因素提供数据支持和揭示乳腺癌发病机制提供新的依据,还可以为疾病高危人群的早期诊断预防和干预提供理论基础。其次,我们对乳腺癌患者肿瘤组织及相对应癌旁组织标本中Tim-3的表达情况与临床病理特征及预后的相关性进行探讨,并进一步通过靶向沉默和过表达Tim-3分子来研究Tim-3对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,识别癌细胞增殖和转移的新型分子机制,为乳腺癌诊治提供新策略、新思路。第一部分Tim-3基因多态性与乳腺癌易感性、临床病理特征及预后的关系研究[研究目的]乳腺癌是环境因素和遗传因素共同作用的结果。乳腺癌的遗传因素涉及多个基因,这些基因的单核苷酸多态性及其特定组合可能是造成癌症易感性最重要的原因。国内外的研究显示Tim-3基因的启动子区和编码区均存在多态性的变化,这些多态性可能与多种疾病的易感性相关。在本研究中,我们将探讨在我国北方地区汉族女性人群中位于Tim-3基因启动子区域-rs10053538(GT)-1516位置、启动子区域rs10515746(GT)-574 位置以及位于 Tim-3 基因外显子 rs1036199(TG)+4259位置的单核苷酸多态性与乳腺癌易感性之间的关联,同时通过比较Tim-3多态性与临床病理学特征之间的关系来探讨其和乳腺癌进展和预后的关系。[研究方法]我们随机招募了 301名浸润性乳腺癌患者和151名健康对照者作为研究对象。采集受试者静脉血2-3ml,进行基因组DNA样本的提取。收集样本进行巢式PCR扩增、测序,测序文件采用Sequencher 5.0软件与Tim-3基因3个SNP周围序列进行比对,观察待测SNP位置核苷酸类型。实验结果运用SPSS19.0软件进行数据统计分析。运用χ2检验或Fisher确切概率法比较观察到的和预期的基因型频率;运用SHEsis软件进行Hardy-Weinberg平衡分析、单倍体和连锁不平衡分析。非条件logistic回归计算优势比(OR)及其95%可信区间(CI),估计各种危险因素与乳腺癌发病风险的关联强度。[研究结果]1.-1516G/T和-574G/T位点基因型及等位基因频率在乳腺癌患者和健康对照中的分布没有差异,这两个位点SNP与乳腺癌发病风险没有相关性(P0.05)。+4259T/G位点TT、TG基因型在对照组和乳腺癌组分别为98.7%和1.3%,90.7%和9.3%,TG基因型频率在乳腺癌组明显高于对照组,显著增加乳腺癌的发病风险(OR7.641,95%CI,1.795-32.522,P= 0.001);+4259T/G等位基因G频率在乳腺癌中明显升高,均明显增加乳腺癌的发病风险(OR7.317,95%CI,1.731-30.925,P= 0.001)。2.-1516G/T和-574G/T位点的基因频率和乳腺癌患者组织学分级、肿瘤大小,淋巴结或远处转移没有明显的统计学意义无显著差异(P0.05);而+ 4259T/G位点基因多态性与乳腺癌患者组织学分级、肿瘤大小无关,而与肿瘤淋巴转移或远处转移有关,携带TG基因型的乳腺癌伴有肿瘤转移的概率分别是携带TT基因型女性的3.158倍(OR3.158,95%CI:1.300-7.672,P=0.011)。3.+ 4259TG基因型与ER、PR和HER-2没有显著关联(P0.05),而与Ki-67增殖标记指数相关(OR 2.632,95%CI:1.121-6.179,P=0.022)。[研究结论]Tim-3基因启动子区域的-1516G/T和-574G/T位点SNP与乳腺癌的易感性无关,而外显子区域的+4259TG单核苷酸多态性位点与乳腺癌患者的遗传易感性有关;并且Tim-3基因+ 4259T/G位点SNP多态性与肿瘤转移和Ki-67增殖指数相关,提示Tim-3基因+4259T/G多态性可作为中国北方汉族女性浸润性乳腺癌的候选易感基因以及预测乳腺癌患者进展和预后的一个重要分子标志物。第二部分Tim-3在乳腺癌组织表达及与临床病理特征和预后的研究[研究目的]Tim-3作为抗肿瘤免疫的负性调节因子,在肿瘤免疫、器官移植、炎性疾病和自身免疫性疾病等过程中发挥着重要作用。其促进肿瘤免疫逃逸、侵袭、转移、复发的分子机制引起了很多学者的关注,通过其机制的研究以及与其特异性结合并抑制其表达的分子或者单克隆抗体等免疫检查点抑制剂的研制,对预测肿瘤预后以及实现肿瘤免疫治疗有着重要的学术价值和社会价值。研究证实,Tim-3表达并不局限于免疫细胞,也异位表达在一系列正常和恶性组织中,在促进肿瘤侵袭、转移过程中发挥重要作用,并且其表达与患者预后不良相关。本部分研究中,我们分别检测乳腺癌患者肿瘤组织及相对应癌旁正常组织标本中Tim-3 mRNA水平和蛋白质水平的表达情况,并分析其在乳腺癌肿瘤组织中的表达与临床病理特征及预后之间的相关性,探讨Tim-3在乳腺癌的发生、发展以及预后中的作用。[研究方法]我们随机选择2011年至2012在山东大学附属山东省立医院收治的42例浸润性乳腺癌患者。收集常规手术乳腺癌组织及癌旁正常组织标本经常规石蜡包埋,组织切片用于组织免疫化学检测。另外随机收集2015年手术切除的新鲜乳腺癌组织及相应癌旁组织标本20例,用于实时定量PCR和Western blot检测。此外,分析乳腺癌肿瘤组织中的Tim-3表达水平与患者临床病理特征包括年龄、肿瘤组织学分级、肿瘤大小、转移情况、临床分期以及相对应免疫组化指标PR、ER、p53、Ki-67指数及总生存期(OS)的关联。所有实验数据使用SPSS 19.0软件进行统计分析。[研究结果]1.免疫组织化学结果显示,Tim-3蛋白主要定位于乳腺癌细胞的细胞质和细胞膜中。42例乳腺癌组织中,Tim-3阳性表达18例,阳性表达率为42.9%。42例相应癌旁正常组织中,Tim-3蛋白阳性表达4例,阳性表达率为18.2%,乳腺癌组织中Tim-3蛋白阳性率明显高于癌旁组织(P0.01)。Tim-3蛋白表达进一步通过半定量免疫反应评分比较,乳腺癌组织比癌旁正常组织显示更高的分数(P0.01)。2.收集新鲜乳腺癌及相应癌旁正常组织,进一步提取蛋白,用Western blot法在蛋白水平进行验证,可见这两种组织的泳道均有Tim-3蛋白条带,乳腺癌组织表达相对较癌旁组织强;用qRT-PCR在mRNA水平进行Tim-3检测,结果显示,乳腺癌组织及相应癌旁正常组织均有Tim-3 mRNA的表达,且Tim-3 mRNA在乳腺癌组织中的相对表达量明显高于相应癌旁正常组织(P0.001)。3.统计分析Tim-3蛋白表达水平与临床病理特征的关系结果显示,Tim-3表达水平半定量免疫反应评分,与临床分期(P= 0.0278)、转移(P=0.0207)以及免疫组化Ki-67指数(P=0.0444)密切相关,而与年龄(P0.05)、组织学类型(P0.05)、肿瘤大小(P0.05)以及常用免疫组化指标PR、ER、p53染色(P0.05)无显著相关性。4.Tim-3表达阴性组的乳腺癌患者5年生存率为95.8%,而Tim-3阳性组5年生存率为72.2%,Kaplan-Meier生存分析显示,Tim-3阳性表达组患者较Tim-3表达阴性组具有更短的生存时间(log-rank χ2=5.171,P=0.023)。[研究结论]1.Tim-3在人乳腺癌组织中Tim-3蛋白及mRNA水平均异常高表达,提示Tim-3表达可能和乳腺癌的发生、发展相关。2.Tim-3表达水平与乳腺癌的临床分期、肿瘤转移、免疫组化Ki-67增殖指数以及生存期密切相关,提示其与肿瘤进展及患者不良预后密切相关。第三部分Tim-3对乳腺癌细胞生物学行为的作用及机制研究[研究目的]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,快速复发、转移和较差的生存率是肿瘤细胞在体内持续的增殖、激活的侵袭和转移以及正常细胞凋亡抑制引起的。肿瘤细胞的浸袭和转移能力是影响肿瘤患者预后的首要因素,浸袭和转移过程是极其复杂的动态过程,包括癌细胞本身特性、机体免疫、内分泌、代谢与微环境及等多方面因素之间相互作用。EMT过程在乳腺癌的发生、发展中起着非常重要的作用,其与高侵袭性和转移性的乳腺癌之间存在相关性。研究表明,Tim-3在可以触发骨肉瘤肿瘤细胞获得具有侵袭性的EMT特征,并可能参与其中恶性肿瘤的发病机制。我们推断Tim-3促进乳腺癌的发展转移可能与EMT相关,在本部分研究中我们通过过表达和靶向沉默Tim-3分子,明确Tim-3对人乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,进一步探讨Tim-3对乳腺癌细胞侵袭转移的作用机制。[研究方法]采用Western blot方法分别检测乳腺癌MDA-MB-231,MCF-7和MCF-7/ADM细胞中Tim-3蛋白的表达情况。构建沉默Tim-3的Tim3-siRNA和Tim-3过表达质粒pcDNA3.1-Tim-3,分别转染MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞。采用qRT-PCR检测转染细胞中Tim-3mRNA的表达水平,验证转染效率。采用CCK8实验、细胞划痕实验、Transwell小室法和流式细胞术分别检测各组细胞的增殖、迁移能力、侵袭能力和凋亡变化情况。采用Western blot方法检测Tim-3基因表达变化后对EMT转移相关分子(MMP-9、TIMP-1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)表达水平的影响。[研究结果]1.MDA-MB-231,MCF-7和MCF-7/ADM细胞中均有Tim-3蛋白的表达;转染后各组MDA-MB-231和MCF-7细胞中Tim-3 mRNA水平检测结果显示,在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,与control组相比,siTim-3组Tim-3 mRNA表达量均明显降低(P0.05),而Tim-3组Tim-3mRNA的表达量均明显升高(P0.05)。2.细胞增殖实验结果显示,在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,与control组相比,各时间点siTim-3组细胞的增殖活性均明显降低(P0.05),而Tim-3组各时间点细胞的增殖活性均明显增高(P0.05)。细胞划痕实验结果显示,在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,与control组相比,siTim-3组细胞的迁移率明显降低(P0.05),而Tim-3组细胞的迁移率则显著上升(P0.05)。Transwell小室法检测结果显示,在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,与control组相比,siTim-3组的侵袭细胞数明显减少(P0.05),而Tim-3组的侵袭细胞数则明显增多(P0.05)。流式细胞术检测结果表明,在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,与control组相比siTim-3组的细胞凋亡率明显增多(P0.05),而Tim-3组的细胞凋亡率则显著降低(P0.05)。3.在 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞中,与 control 组相比,siTim-3 组 E-cadherin和TIMP-1蛋白的表达水平明显增高(P0.05),而MMP-9、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达水平则显著降低(P0.05);与control组相比,Tim-3组E-cadherin和TIMP-1蛋白的表达水平明显降低(P0.05),而MMP-9、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达水平则明显增高(P0.05)。[研究结论]1.Tim-3在乳腺癌细胞上表达,具有促进乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移和抑制癌细胞凋亡的生物学功能。2.Tim-3可能通过诱导EMT或者促进EMT过程推动乳腺癌细胞的侵袭和转移,从而促进乳腺癌发生发展。
【图文】：

位点,分型,基因,测序

图１邋Ｔｉｍ－３基因－１５１６Ｇ／Ｔ位点的测序分型结果。Ａ：邋ＧＧ型；Ｂ：邋ＴＧ型逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ａｎｄ邋ｔｙｐｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋－１５１６邋Ｇ／Ｔ邋ｌｏｃｕｓ邋ｏｆ邋Ｔｉｍ－３邋ｇｅｎｅ．逡逑Ａ：邋ＧＧ邋Ｔｙｐｅ；邋Ｂ：邋ＧＴ邋ｔｙｐｅ逡逑３７６逦＿＿邋ｒａｏ逡逑ｒ邋Ｇ邋Ｇ邋Ｇ邋＊邋Ｇ邋ｒ邋Ｔ邋Ｇ邋Ｃ逦＊邋Ｔ邋Ｇ邋Ｇ邋Ｔ邋Ｃ邋１邋Ｇ邋Ｔ邋Ａ逦Ａ逦Ａ邋ＴＧＩ逡逑ｉｈＭＭｋ逡逑＜ｚｚ＞逡逑Ｂ逡逑

位点,分型,基因,测序

ＴＧ邋＜５逦＊邋Ｔ邋Ｃ邋Ｇ邋Ｃ邋Ｃ逦ｒ邋Ｃ邋ＡＧ邋ｅｒｅ逦ＯＧ邋Ａ邋Ｏ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｃ邋Ａ逡逑Ａ邋ｎ邋＾逦Ａ邋ｒｊ逡逑ＭＭＭｈＭ逡逑２９０逦３００逡逑Ｇ邋ｉ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｇ邋Ｃ邋Ｃ邋Ｔ邋Ｇ邋ＡＧ邋Ｇ邋Ｔ邋Ｃ邋（ＩＴ）邋Ｇ邋Ｇ逦（Ｓ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｃ邋Ａ邋Ａ邋＇逡逑Ｂ逦ｎ邋ａ邋ｌ逡逑ｉｈＭＭＡＭｆｃ逡逑图１邋Ｔｉｍ－３基因－１５１６Ｇ／Ｔ位点的测序分型结果。Ａ：邋ＧＧ型；Ｂ：邋ＴＧ型逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ａｎｄ邋ｔｙｐｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋－１５１６邋Ｇ／Ｔ邋ｌｏｃｕｓ邋ｏｆ邋Ｔｉｍ－３邋ｇｅｎｅ．逡逑Ａ：邋ＧＧ邋Ｔｙｐｅ；邋Ｂ：邋ＧＴ邋ｔｙｐｅ逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

【参考文献】