沉默ARID1A通过EMT过程促进胃癌细胞增殖、侵袭及初步机制

发布时间：2020-06-11 08:21

【摘要】：【目的】通过慢病毒(载有特定靶向于人ARID1A基因的shRNA)转染AGS和SGC7901胃癌细胞,构建沉默ARID1A基因的稳转细胞株模型。探讨沉默ARID1A基因对上皮间质转化(EMT)过程的影响以及是否促进胃癌细胞增殖、侵袭,通过蛋白水平初步探讨沉默ARID1A影响EMT过程的可能分子机制。【方法】1.通过实时荧光相对定量PCR(RT-qPCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)检测胃癌细胞中ARID1A基因mRNA及蛋白水平表达情况。2.构建慢病毒(载有特定靶向于人ARID1A基因的shRNA)载体,转染胃癌细胞株AGS、SGC7901,并用嘌呤霉素进行筛选。经RT-qPCR和Western blot法从mRNA及蛋白水平验证ARID1A基因敲减效果,获得沉默ARID1A基因的稳转胃癌细胞株。3.运用倒置显微镜观察敲减ARID1A基因前后胃癌细胞形态的变化;敲减ARID1A基因对胃癌细胞上皮间质转化(EMT)过程的影响:Western blot检测上皮标志物E-钙黏素(E-cadherin),间质标志物N-钙黏素(N-cadherin)、Vimentin。4.通过CCK8及Transwell实验检测沉默ARID1A基因后,胃癌细胞增殖活性及细胞侵袭能力等生物学行为的变化。5.沉默ARID1A引起EMT相关信号通路PI3K/Akt蛋白的变化:Western blot检测PI3K、Akt、p-Akt(S473)。【结果】1.ARID1A基因在胃癌细胞株中均有表达,选择ARID1A相对高表达的胃癌细胞AGS及SGC7901进行后续实验。2.构建ARID1A-shRNA重组载体的慢病毒转染胃癌细胞株,并成功筛选出稳定沉默ARID1A的胃癌细胞株。RT-qPCR结果显示:AGS、SGC7901细胞经慢病毒转染后,与阴性空载体对照组相比,基因沉默组ARID1A mRNA水平表达明显下调(P0.01)。Western blot结果显示:与阴性空载体对照组相比,基因沉默组ARID1A蛋白表达下调(P0.01、P0.001)。3.沉默ARID1A基因后细胞形态由紧密的上皮形态变为疏松的间质形态,进而提取细胞总蛋白质,Western blot检测上皮间质转化(EMT)过程的相关蛋白变化,观察到上皮标志物E-cadherin表达下降,间质标志物N-cadherin、Vimentin上升,提示敲减ARID1A基因诱导上皮间质转化。4.CCK8法检测细胞增殖活性结果显示:AGS、SGC7901细胞种板后早期(12h内),ARID1A基因沉默组与阴性空载体组相比,细胞增殖活性在统计学上无明显差异(P0.05);但在种板的24h、48h、72h,与阴性空载体组相比,ARID1A基因沉默组增殖活性增高,差异有统计学意义(P0.001、P0.0001)。Transwell侵袭实验结果显示,与阴性空载体组相比,基因沉默组更多胃癌细胞穿过基质胶,细胞侵袭能力明显增加,差异有统计学意义((P0.001、P0.0001)。本结果提示我们:下调ARID1A基因可促进胃癌细胞增殖和侵袭。5.Western blot结果显示:与阴性空载体组相比,稳定沉默ARID1A的SGC7901细胞中,ARID1A表达水平显著降低,同时发现PI3K表达上调,总Akt蛋白表达无差异,但是Akt的磷酸化(pAKT-Ser473)水平升高。提示沉默ARID1A可能通过上调PI3K蛋白表达进而影响下游Akt磷酸化,激活PI3K/Akt通路。【结论】1.敲减ARID1A促进胃癌细胞增殖和侵袭。2.沉默ARID1A可能通过上调PI3K蛋白表达,影响下游Akt磷酸化,激活PI3K/Akt通路,诱导胃癌细胞发生上皮间质转化(EMT),进而促进细胞增殖和侵袭。
【图文】：

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福建医科大学硕士学位论文结果3.1 胃癌细胞株 ARID1A mRNA 转录水平收集对数生长期胃癌细胞 MGC-803、AGS、SGC7901、MKN45、BGC823，提取 RNA，并逆转录成 cDNA,RT-qPCR 仪检测 ARID1A mRNA 水平的表达情况。实时荧光定量 PCR 检测结果显示(图 1)：ARID1A 在 5 种胃癌细胞株的 mRNA 水平均有表达，其中在 AGS、SGC7901 及 MGC-803 细胞中表达相对较高。

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图 2 A：5 种胃癌细胞 ARID1A 蛋白表达情况 B:ARID1A/GAPDH 的相对灰度值（*、**分别表示与 MKN45 细胞相比，另外 4 种胃癌细胞 ARID1A 蛋白水平 P<0.05、P＜0.01）3.3 筛选稳定沉默 ARID1A 表达的胃癌细胞株3.3.1 RT-qPCR 法验证 ARID1A 基因慢病毒 shRNA 干扰效果胃癌细胞 AGS、SGC7901 种板 12h 贴壁后换液，加入慢病毒转染，培养 24h后换液，，用终浓度为 4μg/ul 的嘌呤霉素（puromycin）进行筛选，转染 5 天后收集细胞，提取细胞总 RNA，用 RT-qPCR 法检测 AGS、SGC7901 胃癌细胞株 mRNA水平的表达变化。结果显示（如图 3）：AGS、SGC7901 细胞经慢病毒转染后，与阴性空载体对照组相比(NC)，基因沉默组（KD）ARID1A mRNA 水平表达明显下调。通过 GraphPad Prism 6 图像分析软件及 SPSS 统计分析，沉默组与对照组细胞株间差异有统计学上的意义(P<0.01)，达到实验筛选要求。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

【参考文献】