急性B淋巴细胞白血病人源化小鼠的T淋巴细胞免疫治疗研究

发布时间：2020-06-12 00:30

【摘要】：背景及目的:ALL是淋巴细胞系前体细胞的克隆性增殖性疾病。尽管应用目前的治疗手段,B-ALL缓解率逐渐提高,但患者耐药及复发后的二次缓解比例较低,整体预后不良。抗CD19 CAR T细胞治疗B-ALL可以靶向杀伤白血病细胞,提高难治复发患者的缓解率,并为造血干细胞移植争取机会。但由于白血病细胞免疫逃逸、骨髓中微小残存病灶的存在及肿瘤微环境中的保护机制,使患者不能达到长期缓解。同时抗CD19 CAR T细胞治疗临床试验的患者会出现一系列治疗相关的不良反应,严重的不良反应将威胁患者生命。目前尚缺乏模拟B-ALL患者接受同源CAR T细胞治疗的动物模型。另外,增强T细胞清除残存白血病病灶的治疗方法尚需进一步探索。本研究以人源化小鼠为基础,通过建立MLL-AF9融合基因诱导的人B-ALL人源化小鼠模型为受者,应用同基因人源化小鼠T细胞制备的抗CD19 CAR T细胞进行治疗。建立模拟临床患者的患病及CAR T细胞治疗过程的小鼠模型。白血病小鼠模型中的人B-ALL细胞表达CXCR4,其与白血病细胞的归巢、治疗抵抗及疾病复发相关,通过阻断基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1,SDF-1/CXCL12)/CXCR4通路,探索增强T细胞免疫杀伤B-ALL细胞的方法。方法:在实验一,构建人B-ALL人源化小鼠模型,应用同基因抗CD19 CAR T细胞进行治疗。1.建立MLL-AF9诱导的人B-ALL人源化小鼠模型。分离人源化小鼠T细胞,制备抗CD19 CAR T细胞。应用抗CD19 CAR T细胞治疗B-ALL人源化小鼠模型。2.流式分析仪对小鼠模型的白血病细胞、抗CD19 CAR T细胞及其他免疫细胞进行分析,检测抗CD19 CAR T细胞在小鼠体内增殖及存活情况、白血病细胞增殖及被杀伤情况。3.监测小鼠血清细胞因子及生存情况,观察小鼠CAR T细胞治疗后细胞因子释放与抗白血病效应的相关性及CAR T细胞治疗效果。在实验二,以人B-ALL NSG小鼠为模型,应用异基因T细胞杀伤白血病细胞。探索能否应用CXCR4拮抗剂阻断SDF-1/CXCR4通路,使白血病细胞进入外周,从而增强T细胞杀伤白血病细胞效果。1.建立B-ALL NSG小鼠模型,应用异基因T细胞在体内杀伤白血病细胞。2.注射CXCR4拮抗剂AMD3100。3.检测小鼠外周血各种细胞的比例及数量,观察白血病细胞被杀伤情况及异基因移植后移植物抗宿主反应。4.监测小鼠生存期、检测小鼠组织器官中白血病细胞数量及比例,观察残存白血病细胞被清除的情况。5.过继移植治疗后小鼠骨髓细胞到NSG小鼠体内,监测疾病长期缓解情况。结果:实验一:1.通过人类胚胎胸腺及胚胎肝脏CD34+细胞移植建立人源化小鼠模型。在移植后第7周人源化小鼠人类细胞嵌合率达49%以上。构建人B-ALL人源化小鼠模型。2.CAR T细胞制备及体外扩增。分离人源化小鼠脾脏中T细胞,制备抗CD19 CAR T细胞及对照组CAR T细胞,并在体外扩增。转染率分别为73%和45.3%。3.B-ALL人源化小鼠接受CAR T细胞输注治疗,发挥抗CD19阳性细胞作用。CAR T细胞输注后第1、2和第4周,抗CD19 CAR T细胞治疗组小鼠B淋巴细胞明显少于对照CAR T细胞治疗组,P值分别为0.0144,0.0047和0.0059。第6和第8周,抗CD19 CAR T细胞治疗组小鼠白血病细胞明显少于对照CAR T细胞治疗组,P值分别为0.0001和0.0048。4.B-ALL人源化小鼠抗CD19 CAR T细胞治疗后血清中细胞因子释放。治疗后第1周抗CD19 CAR T治疗组小鼠血清中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)及白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)显著性高于对照CAR T治疗组,P值分别为0.0095和0.0422;治疗后第4周抗CD19 CAR T治疗组小鼠血清中γ干扰素(interferon-γ,INF-γ)显著性高于对照CAR T治疗组,P值为0.0161。5.抗CD19 CAR T细胞治疗延长B-ALL人源化小鼠生存时间。对照CAR T细胞治疗组小鼠生存时间为51~82天(中位生存时间为72天),抗CD19 CAR T治疗组小鼠生存时间为CAR T细胞治疗后86~120天(中位生存时间为99天),生存期明显长于对照CAR T治疗组小鼠,P值为0.003。实验二:1.小鼠骨髓中白血病细胞较外周组织抵抗T细胞治疗。白血病NSG小鼠接受异基因T细胞治疗,小鼠骨髓中的白血病细胞比例明显高于外周血、脾脏、肝脏、肺及肾脏(P0.001)。2.B-ALL NSG小鼠白血病细胞表达CXCR4。3.CXCR4拮抗剂使ALL NSG小鼠白血病细胞进入外周血。给予B-ALL NSG小鼠注射AMD3100(以下简称AMD)或PBS。第一次及最后一次给药后3、6和12 h AMD组小鼠外周血白血病细胞的比例和细胞计数明显高于PBS组。第1次给药后第7天AMD组小鼠外周血细胞比例及计数均显著性低于PBS组,P值分别为0.0359和0.001,而第21天及28天两组小鼠外周血白血病细胞无统计学意义。两组小鼠组织器官中白血病细胞数无统计学意义。4.CXCR4拮抗剂协助供体淋巴细胞输注(donor lymphocyte injection,DLI)增强移植物抗白血病(graft-versus-leukemia,GVL)效应。DLI联合AMD治疗组在第15天,外周血白血病细胞水平明显低于DLI联合PBS对照组,P值为0.0001。DLI后第25天,DLI联合AMD组小鼠骨髓白血病细胞的比例明显低于DLI联合PBS组,P值为0.0075。5.CXCR4拮抗剂联合DLI在更具侵袭性的B-ALL NSG模型中也可以达到清除白血病作用。在白血病细胞增殖较快的B-ALL NSG小鼠模型中,给予两轮DLI联合AMD/PBS治疗。首次治疗后第31天AMD组小鼠(2/5小鼠未检测到GFP+细胞)外周血白血病百分比和计数明显低于PBS组,P值分别为0.0098和0.007;AMD组小鼠骨髓中白血病细胞计数明显低于PBS组,P值为0.0174。DLI联合AMD/PBS小鼠骨髓作为1代小鼠,骨髓细胞移植给2代NSG小鼠。AMD组2代小鼠外周血白血病细胞明显低于PBS组2代小鼠,第5、6、7及第8周P值分别为0.033、0.0077、0.0133和0.0829。AMD组1只2代小鼠23周均未检测出白血病细胞。结论:1.用人源化小鼠脾脏T淋巴细胞构建的CD19 CAR T细胞可以在体外扩增。2.用人源化小鼠脾脏T细胞构建的CD19 CAR T细胞可在B-ALL人源化小鼠体内杀伤普通的人B淋巴细胞及白血病细胞。3.应用CD19 CAR T细胞治疗的B-ALL人源化小鼠血清中细胞因子升高。4.CD19 CAR T细胞存活和扩增程度与治疗效果呈正相关。5.CD19 CAR T细胞治疗B-ALL人源化小鼠模型能够模拟临床情况,为CAR T细胞抗肿瘤作用评价及改善治疗方法提供良好的模型。6.B-ALL对骨髓中异基因T细胞的杀伤作用不如在外周敏感。7.CXCR4拮抗剂AMD3100可以使骨髓中白血病细胞进入外周。8.在B-ALL NSG小鼠模型中,单纯应用AMD3100不能有效清除白血病细胞。9.应用AMD3100不增加DLI的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)效应。10.CXCR4拮抗剂增强异基因T细胞抗白血病效应。
【图文】：

序列,细胞抗原,受体,基因序列

图1.1 CAR T 细胞抗原受体及其基因序列的演变Figure 1.1 CAR T cell antigen receptor and its gene sequence evolution（A）第1代到第4代CAR T细胞抗原受体的结构改变。scFv ：单链可变区；VH（heavy chainvariable area）：重链可变区；VL（light chain variable area）：轻链可变区；Co-stimulatorymolecule：共刺激分子；HPSE（Heparanase）：肝素酶。（改编自Maude, S. L. CD19-targetedchimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. 2015, Blood[45]）（B）第1代到第4代CAR T细胞抗原受体基因序列演变。TM（trans membrane domain）：跨膜区；LTR（long terminal repeat）：长末端重复序列；IRES（indicates internal ribosome entry site）：内部核糖体进入点，能够使蛋白质翻译起始不依赖于5‘帽结构，核糖体可以直接进入并对其之后的序列进行翻译，从而使直接从信使RNA（mRNA）中间起始翻译成为可能；其之后的序列呈持续表达，，而不依赖于胞外段scFv被目标抗原的活化后向细胞内传导的活化信号。（改编自Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need forprior conditioning. 2012, Blood.[46]）

细胞因子,血管性血友病因子,主要组织相容性复合体,自然杀伤细胞

9图1.2 CRS发生机制[70]Figure 1.2 The mechanism of CRS generation目前已有的报道对CRS发生机制进行了探讨。CRS可由靶细胞的裂解和T细胞的活化所释放的细胞因子所激发，这些细胞因子包括IFN-γ和TNF-α等。接着这些细胞因子又进一步链式反应，激活了巨噬细胞、DC、细胞毒T细胞等，被活化的细胞释放更多的细胞因子，如IL-6、IL-8等。Ang-2：血管生成素2，DC：树突状细胞，MHC-I：主要组织相容性复合体I，NK cell：自然杀伤细胞，TCR：T细胞受体，vWF：血管性血友病因子。（本图来自于Shimabukuro-Vornhagen, A.等人的文章，Cytokine release syndrome. J Immunother Cancer. 2018）
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.71

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