见血封喉苷H诱导肺癌细胞线粒体自噬机制研究

发布时间：2020-06-12 10:39

【摘要】：目的:见血封喉苷H(ToxH)是一种新型强心苷,我们课题组前期研究发现多种强心苷类化合物能引起肿瘤细胞损伤并通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。另外,还有研究发现,强心苷能通过多种信号通路诱导肿瘤细胞自噬。线粒体自噬(Mitophagy)是一种保护线粒体损伤的机制,我们前期研究发现强心苷可导致线粒体膜电位降低并通过线粒体途径促使肿瘤细胞凋亡。为此,我们推测ToxH有可能通过线粒体自噬来保护损伤的细胞。因此,本课题利用分子生物学和细胞生物学等研究手段,进一步了解ToxH是否能够诱导A549和H460两种肺癌细胞线粒体自噬,并研究其分子机理。方法:用不同剂量的ToxH处理A549和H460两种肺癌细胞,并在不同的时间进行观察和检测,通过显微镜直接观察细胞形态,利用MTT实验、EDU实验检测ToxH对肺癌细胞的生长和增殖的情况;通过JC-1染色,显微镜直接观察结果并结合流式细胞术分析线粒体的膜电位变化;用Western Blotting方法检测凋亡、线粒体自噬(包括自噬流)和信号通路相关的蛋白分子表达情况;同时用激光共聚焦显微镜观察自噬标志分子(LC3、P62等)和线粒体自噬标志(Mito-Red)共聚现象,以了解是否产生线粒体自噬;通过RNA干扰(siRNA)或应用自噬阻断剂干扰相应的分子并综合以上方法分析ToxH诱导线粒体自噬与相关分子和自噬的关系;通过免疫共沉淀并结合Western Blotting实验分析线粒体自噬与其相关分子之间的关系。结果:1、通过显微镜直接观察发现,镜下ToxH处理的细胞数量随着剂量增大逐渐变少,细胞间连接消失,细胞逐渐脱落,胞体形状改变,死亡增多。MTT和EDU检测结果表明,ToxH对肺癌细胞的生长和增殖有明显的抑制作用。2、JC-1染色后在荧光显微镜下直接观察,发现没有ToxH处理的细胞呈明显的红色改变,但随着ToxH剂量增加,细胞中绿色部分明显增加;用流式细胞术定量分析膜电位有相同的变化;这些结果说明随着ToxH剂量增加,线粒体膜电位发生改变和线粒体损伤增多。用Western Blotting检测凋亡相关的表达分子,发现经ToxH处理的肺癌细胞线粒体中的细胞色素C(Cyt c)的表达随着ToxH处理时间的延长而越来越低,而胞质中的Cyt c的表达则相应增高;同时裂解的PARP、Caspase-3和Caspase-9的表达也相应增高,但Caspase-8则没有改变,说明ToxH通过损伤线粒体途径诱导肺癌细胞凋亡。3、用Western blotting检测线粒体膜蛋白表达发现,ToxH处理的细胞中Tom20、Tim23、Hsp60等分子的表达明显下调;用共聚焦显微镜观察发现ToxH处理的细胞中LC3斑点的数量明显增多,并且这些LC3斑点和Mito-Red标记的线粒体以及P62分子均有明显的共定位现象;用Western blotting检测胞质和线粒体中的自噬标志分子,发现ToxH处理的细胞的线粒体中含有更多的P62、LC3-II和Parkin,说明ToxH在肺癌细胞中通过Parkin通路诱导线粒体自噬。4、为了更进一步了解ToxH诱导肺癌细胞产生线粒体自噬的分子机理,通过Western blotting检测Sirt3和Tom20的表达,发现ToxH处理的细胞中Sirt3表达明显增高,但Tom20表达明显减少;用RNA干扰Sirt3(siSirt3)表达后Tom20表达恢复正常;同样在siSirt3并ToxH处理的肺癌细胞中,LC3斑点也没有发现和Mito-Red有明显的共聚现象,另外用RNA干扰Parkin(siParkin)或者用自噬阻断剂抑制线粒体自噬后,发现ToxH处理的肺癌细胞的线粒体中也没有检测到明显的P62、LC3-II和Parkin,这些结果说明ToxH通过诱导Sirt3高表达促使肺癌细胞产生线粒体自噬。5、为了明确ToxH诱导肺癌细胞高表达Sirt3的分子机理,我们用Western blotting检测Sirt3、己糖激酶II(hexokinase II,Hex II)、Parkin和电压依赖性阴离子通道蛋白1(VDAC1)之间的关系,发现ToxH处理的细胞中Sirt3表达增高,总Hex II浓度和对照组未处理细胞之间表达差异并没有明显变化;实验分别检测胞质和线粒体中的Hex II,发现ToxH处理后,胞质中的Hex II明显增高,这种现象在siStirt3的细胞中则没有出现,说明ToxH并不能促使Hex II重合成表达,而是促使主要分布在线粒体中的Hex II向胞质转移。用免疫共沉淀的方法检测在过表达Parkin的肺癌细胞中VDAC1、Parkin和Hex II相互作用,发现控制组(siCtrl)中,ToxH处理的细胞中有明显的Parkin和VDAC1共沉淀,没有明显的Hex II和VDAC1共沉淀,ToxH未处理的细胞(UT组)中Hex II和VDAC1共沉淀明显,结果与ToxH组相反。干扰Sirt3表达后,(siSirt3-ToxH)组中Parkin和DVAC1共沉淀消失而Hex II和VDAC1发生共沉淀,UT组结果没明显变化。综合以上结果,说明ToxH诱导肺癌细胞线粒体自噬是通过高表达Sirt3来下调Hex II与VDAC1结合并促使VDAC1和Parkin结合,进而激活线粒体自噬的Parkin通路。6、我们用干扰Sirt3和自噬阻断剂3-MA抑制或阻断ToxH诱导的自噬,然后重复用上述的方法检测细胞的生长、增殖和凋亡情况,发现干扰或阻断线粒体自噬后,ToxH抑制肺癌细胞生长增殖更加明显,通过线粒体途径凋亡的细胞明显增加,说明ToxH诱导的线粒体自噬是一种保护性自噬。结论:实验结果表明:1、ToxH抑制肺癌细胞生长和增殖;2、ToxH通过线粒体途径诱导肺癌细胞凋亡并能促使肺癌细胞产生线粒体自噬;3、ToxH诱导产生线粒体自噬是通过上调Sirt3表达并下调Hex II与VDAC1结合,进而促使VDAC1和Parkin结合,这可能是激活线粒体自噬经典Parkin通路的一种机制;4、ToxH诱导的线粒体自噬是一种保护性的自噬,联合线粒体自噬抑制剂或新型自噬阻断技术有可能是增强ToxH抗肿瘤类药物疗效的重要策略。
【图文】：

剂配制S液：取8 g NaCL，0.2 g KCL，2.88 g Na2HPO4·12H2O，0.2 g K离子水充分溶解，然后定容至1 L，4 °C保存备用。多聚甲醛固定液：将80 g 甲醛溶液溶解在800 ml去离子水中，并均匀搅拌，小心滴入1 N NaOH 溶液5~10滴，静置待液体完液 PH 值到7.4~7.6之间，加入0.02 M 的 D-hanks 1 L，最后用2 L，充分混匀，小心过滤两次，4 °C保存。％聚丙烯酰胺溶液：将290 g丙烯酰胺（Acr）和10 g亚甲双小心加去离子水充分搅拌混匀，然后定容至1 L，4 °C避光保存泳缓冲液：小心将14.4 g 甘氨酸溶液，3 g Tris碱，1 g SDS, 去图 1.见血封喉苷 H（ToxH）的化学结构Figure 1. The chemical structure of toxicarioside H (ToxH)

化学药物抗肿瘤作用最主要的特性就是能够抑制肿瘤细胞生长和增殖，，为此我们先通过观察细胞形态，然后利用 MTT 和 EDU 两种体外实验检测 ToxH是否具有抑制 A549 和 H460 两种肺癌细胞生长和增殖的作用。首先，将不同浓度（0.2、0.4、0.6 μM 三个剂量）的 ToxH 分别培养 A549和 H460 肺癌细胞，对照组用 ToxH 溶剂 DMSO（培养方式和剂量与药物培养细胞相同，等同于 ToxH（0 μM）作为阴性对照，用阿霉素（Doxorubicin，Dox，0.6 或 0.8 μM 两个剂量）作为阳性对照。图 2 是 ToxH 处理 24 小时后 A549和 H460 两种细胞通过倒置显微镜观察到的细胞形态，可见对照组（DMSO）的肺癌细胞在镜下贴壁生长，细胞清晰，相邻细胞融合紧密，随着 ToxH 用药剂量的增加，ToxH 处理的实验组镜下细胞单位面积数量逐渐变少，细胞间连接消失，细胞逐渐脱落，胞体形状改变，死亡增多，说明 ToxH 对 A549 和 H460细胞具有细胞毒作用，这种细胞毒作用随着 ToxH 药物浓度的增加而增高。
【学位授予单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

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本文编号：2709410