桑色素通过miR-155调控GATA3增强紫杉醇对前列腺癌化疗的作用和机制研究
发布时间：2020-06-12 14:43
【摘要】：1.研究背景前列腺癌是全球男性癌症死亡率较高的癌症之一。尽管早期前列腺癌预后较好甚至可以治愈,但是高级别转移性前列腺癌的男性患者平均生存时间小于2年。早期前列腺癌的首选治疗方式是根治性手术,而转移性前列腺癌患者经内分泌治疗失效后继而进展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)后,化疗将成为一种重要治疗方式。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是广谱抗肿瘤药物,是公认的治疗去势抵抗性前列腺癌,能有效延长患者总生存期的一线用药。然而,即使在各种辅助用药的帮助下,去势抵抗性前列腺癌患者经紫杉醇及其衍生物多西他赛(docetaxel)等药物治疗后一方面副作用较明显,另一方面大多也会产生耐药性,肿瘤进展加快。此时患者只能寻求阿比特龙(Abiraterone acetate)等药物治疗,然而阿比特龙费用高昂,相当一部分患者难以承受。因此,研发能增强紫杉醇对前列腺癌的治疗效果并减少紫杉醇用量的药物非常重要。以桑色素(morin)为代表的多种黄酮类化合物(flavonoids)具有抗肿瘤作用,在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、白血病等多种恶性肿瘤中能够调控细胞存活、增殖以及凋亡相关的基因,促进内源性细胞凋亡通路,并能够增强多种肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。有研究者报道桑色素处理LNcap细胞后肿瘤细胞凋亡水平显著增高。在乳腺癌中,桑色素也能够有效逆转肿瘤细胞的恶性表型。同时,在多项研究中,研究者们发现包括桑色素在内的多种黄酮类化合物与紫杉醇类联用能够增强紫杉醇的抗癌作用。在小鼠实验中,桑色素联合紫杉醇口服给药能够显著改善紫杉醇的药效动力学,增强紫杉醇的抗肿瘤效果。芹菜素、柚皮素、黄芩苷、槲皮素和杨梅素等多种黄酮类化合物,与多西他赛联合口服给药时能增强多西他赛的生物利用度。而另一种新型黄酮类化合物VCN-2能够抑制LNcap、DU145和PC-3细胞的增殖并促进肿瘤细胞凋亡,而且其与多西他赛联用时效果显著强于单用任意一种,这种作用在去势抵抗性前列腺癌中更为显著。而且,桑色素等黄酮类化合物在体外和体内实验中展现出良好的安全性。然而,总体而言,桑色素等药物在前列腺癌中的作用仍研究有限,作用机制也尚不明确。2.研究目的本研究拟探索桑色素能否增强紫杉醇治疗前列腺癌的效果。研究证实桑色素能够增强紫杉醇的抗癌作用后,进一步研究其作用机制。3.方法选择前列腺癌细胞系DU145和PC-3作为研究对象。分别在体外、体内条件下,研究桑色素对紫杉醇治疗前列腺癌效果的影响及其分子机制。3.1体外实验及体内实验研究桑色素对紫杉醇化疗前列腺癌细胞效果的影响(1)分别用不同浓度(0、10 μM、20 μM、50μM)桑色素联合同等浓度(50 nM,50 nmol/L)紫杉醇处理 DU145 细胞和 PC-3 细胞,以 DMSO(Dimethyl Sulphoxide,二甲基亚砜,溶剂)处理的细胞作为空白对照。CCK-8法检测细胞活力,通过流式细胞仪以AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡水平。选定理想的桑色素作用浓度。(2)同等浓度桑色素联合不同浓度(0-100 nM)紫杉醇处理DU145和PC-3细胞,检测细胞活力和凋亡水平。研究桑色素对于不同浓度的紫杉醇抗肿瘤效果的影响。(3)以DU145细胞建立荷瘤裸鼠模型,研究桑色素在体内对紫杉醇治疗前列腺癌效果的影响。将20只雄性裸鼠随机分为4组,每组5只,双侧肩背部皮下接种等量DU145细胞后,通过尾静脉注射给药,分别为:①DMSO、②紫杉醇、③桑色素、④紫杉醇+桑色素,以DMSO注射组作为空白对照。肿瘤种植25天后颈椎脱臼法处死裸鼠,完整切除肿瘤并拍照、称重。3.2体外实验及体内实验研究桑色素增强紫杉醇治疗前列腺癌效果的分子机制(1)筛选桑色素的目的miRNA:①通过miRNA芯片(miRNA microarray)技术,检测桑色素处理的DU145细胞中miRNA表达谱的变化,筛选miRNA芯片的结果中差异显著的miRNA;②通过实时荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)在DU145细胞和PC-3细胞中验证,选定miR-155作为主要研究对象;③构建miR-155沉默的DU145、PC-3细胞株和miR-155过表达的DU145、PC-3细胞株以备研究。(2)研究miR-155对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响:①紫杉醇处理miR-155沉默或过表达的DU145细胞和PC-3细胞,以DMSO处理阴性转染细胞作为空白对照,以紫杉醇处理阴性转染细胞作为组内对照,检测细胞活力和凋亡水平;②紫杉醇联用桑色素处理miR-155过表达的DU145和PC-3细胞,检测细胞活力和细胞凋亡水平,进一步验证。(3)筛选miR-155的下游靶基因:①通过Targetscan和miRWalk靶基因预测网站对miR-155的潜在靶基因进行预测,结合芯片检测及qRT-PCR检测,筛选miR-155潜在靶基因;②采用荧光素酶报告系统对 miR-155 潜在靶点 GATA3(GATA binding protein 3,GATA结合蛋白3)基因进行验证;③蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测miR-155 对 GATA3 蛋 白表达水平的影响。(4)检测GATA3基因对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响:①检测前列腺癌癌旁正常组织和肿瘤组织中GATA3的mRNA表达水平;②DU145细胞和PC-3细胞沉默或过表达GATA3,以阴性转染为对照,经紫杉醇处理后检测细胞活力及凋亡水平。(5)研究桑色素通过miR-155对GATA3表达水平的调控作用:①体外实验,Western blot检测药物处理对DU145细胞和PC-3细胞中GATA3表达水平的影响;②检测裸鼠成瘤实验中各组裸鼠肿瘤GATA3表达水平。3.3免疫组化检测选取Ki67、cleaved caspase-3、GATA3在裸鼠肿瘤中行免疫组化检测,验证桑色素对肿瘤细胞增殖、凋亡和靶基因表达水平的影响。3.4数据分析实验数据使用SPSS version 13.0(IBM,Armonk,NY,USA)软件分析,结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。多组数据之间的差异比较采用单因素或双因素方差分析。两组数据之间的差异比较采用T检验分析。p值0.05定义为差异有统计学意义。4.结果4.1桑色素在体外增强紫杉醇对前列腺癌细胞的化疗效果(1)分别以0、10μM、20μM、50 μM桑色素联合50 nM紫杉醇处理DU145细胞和PC-3细胞时,50 μM桑色素作用于两种细胞抑制细胞增殖、促进细胞凋亡效果最为显著。选取50 μM为本研究中桑色素的作用浓度。(2)50μM桑色素与不同浓度紫杉醇联用处理DU145和PC-3细胞,能够显著降低这两种细胞的活力,增加细胞的凋亡水平。4.2桑色素在体内增强紫杉醇对前列腺癌细胞的化疗效果在前列腺癌细胞DU145建立的荷瘤裸鼠模型中,桑色素联合紫杉醇处理能够使肿瘤生长速度显著减缓,增强紫杉醇在体内的抗肿瘤作用。4.3桑色素抑制前列腺癌细胞中miR-155的表达(1)芯片检测发现在桑色素处理后的DU145细胞中有39种miRNA表达水平与对照组相比存在明显差异,其中以miR-155的差异最为显著。(2)qRT-PCR检测发现桑色素处理的DU145细胞和PC-3细胞中miR-155的表达水平显著低于对照组。4.4沉默miR-155增强紫杉醇对前列腺癌细胞的化疗效果,过表达miR-155抑制紫杉醇对前列腺癌细胞的化疗效果并逆转桑色素对紫杉醇化疗效果的增强作用(1)转染anti-miR-155沉默miR-155后,DU145细胞和PC-3细胞经紫杉醇处理,以阴性转染为对照,细胞活力显著低于对照组,凋亡水平显著高于对照组。(2)转染miR-155 mimics过表达miR-155后,DU145细胞和PC-3细胞经紫杉醇处理,以阴性转染为对照,细胞活力显著高于对照组,凋亡水平显著低于对照组。(3)阴性转染的DU145细胞和PC-3细胞经桑色素联合紫杉醇处理,细胞活力显著低于单用紫杉醇组,凋亡水平显著高于单用紫杉醇组。过表达miR-155的DU145细胞和PC-3细胞经桑色素联合紫杉醇处理后,细胞活力显著高于阴性转染的DU145细胞和PC-3细胞,凋亡水平显著低于阴性转染的DU145细胞和PC-3细胞。4.5 GATA3基因是miR-155的下游靶基因,表达受miR-155调控(1)以Targetscan和miRWalk对miR-155潜在靶基因进行预测,结合芯片结果中桑色素处理后差异表达的基因,在5348个差异表达的基因中,PAK2、XRN1以及GATA3最有可能是miR-155的靶基因。(2)qRT-PCR检测,在mi R-155过表达的DU145细胞和PC-3细胞中PAK2、XRN1、GATA3的表达水平均受到不同程度的抑制。miR-155过表达对GATA3抑制显著强于对PAK2和XRN1的抑制作用,因此选取GATA3基因进一步研究。(3)荧光素酶报告基因检测,GATA3是miR-155的靶基因。(4)Western blot检测,在两种前列腺癌细胞中,沉默miR-155可增加GATA3表达,过表达miR-155可抑制GATA3表达。4.6前列腺癌组织中GATA3表达显著低于癌旁正常组织,桑色素在体外和体内能上调GATA3基因的表达进而增强紫杉醇的抗肿瘤效果(1)检测15例前列腺癌癌旁正常组织和33例前列腺癌组织中GATA3的mRNA表达水平。GATA3在前列腺癌组织中的mRNA表达水平显著低于癌旁正常组织。(2)GATA3过表达增强紫杉醇对DU145细胞和PC-3细胞的化疗效果。细胞活力显著降低,细胞凋亡显著增加。转染siRNA以抑制GATA3表达,前列腺癌细胞对紫杉醇处理的敏感性显著降低。(3)Western blot检测,单用桑色素增加前列腺癌细胞内GATA3的表达水平,与紫杉醇联用时GATA3的表达水平进一步增加。在miR-155过表达的前列腺癌细胞中,桑色素对GATA3表达水平的增强明显被抑制。(4)裸鼠肿瘤行Western blot检测,桑色素可显著增强GATA3表达,与紫杉醇联用组肿瘤中GATA3表达水平最高。4.7免疫组化检测显示桑色素联合紫杉醇作用于前列腺癌能抑制肿瘤细胞增殖并促进细胞凋亡桑色素与紫杉醇联合应用在体内降低前列腺癌细胞Ki67表达,增高cleaved caspase-3的表达,从而抑制前列腺癌细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。GATA3在4组肿瘤中无阳性染色。综上,桑色素抑制前列腺癌细胞中miR-155的表达,进一步增强GATA3表达。GATA3过表达能显著增强紫杉醇对DU145和PC-3细胞的化疗效果。因此,桑色素与紫杉醇联用处理前列腺癌细胞时,桑色素通过抑制miR-155表达上调GATA3表达,进而增强紫杉醇对前列腺癌细胞的化疗作用。5.结论桑色素和紫杉醇联合应用在体外实验中处理前列腺癌细胞DU145和PC-3显著抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。体内实验中,桑色素与紫杉醇联用使肿瘤的生长速度显著减缓。桑色素增强紫杉醇在体内的抗肿瘤作用。桑色素显著抑制前列腺癌细胞中miR-155的表达,上调GATA3的表达。GATA3是miR-155调控的靶基因。桑色素增强紫杉醇对前列腺癌化疗效果的作用是通过抑制miR-155进而上调GATA3表达来实现的。
【图文】：
逑５．附图逡逑图１逡逑Ａ逦ＤＵ１４５逦Ｂ逦ＰＣ－３逡逑１００逦—逦１００逦ｒ１１］逡逑１邋ｋｌＬ邋Ｓ邋ｔ0Ｕ＿逡逑桑色素邋0ｉＭ）邋０．０邋０．０邋ｌ0邋２０邋５０逦桑色索（＿）邋0．0邋０．０邋ｌ0邋２０邋５０逡逑栜薛（ｎＭｉ邋0．0邋ｓｏ邋５０邋５０邋５０逦＾Ｓ（ｎＭ）邋0．0邋５０邋５０邋５０邋５０逡逑图１示ＤＵ１４５细胞和ＰＣ－３细胞在５０邋ｎＭ紫杉醇联合各浓度桑色素处理４８小时逡逑后，检测细胞活力。逡逑（Ａ）逦ＤＵ１４５细胞活力检测。以桑色素浓度为０处理组细胞活力值作为基数，逡逑其余各组细胞的活力值以占基数的比值（％）的方式比对。桑色素５０叫组效果逡逑最显著。＊＊Ｐ〈０．邋０１，表示与空白对照组有显著差异。逡逑（Ｂ）逦ＰＣ－３细胞活力检测。以桑色素浓度为０处理组细胞活力值作为基数，逡逑其余各组细胞的活力值以占基数的比值（％）的方式比对。桑色素５０叫组效果逡逑最显著。＊＊Ｐ＜０．邋０１，表示与空白对照组有显著差异。逡逑３４逡逑
逡逑图２逡逑Ａ逦逦ＤＵ１４５逦逡逑，，紫杉＊邋＋U可
本文编号：2709680
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