MiR-637通过靶向调控CTSB抑制胆管癌QBC939细胞增殖与活力

发布时间：2020-06-12 18:19

【摘要】：[目的]MiR-637对肝细胞癌及脑胶质细胞瘤的抑制作用已有报道,miR-637被报道在胆管癌组织中低表达,miR-637对胆管癌的功能作用及机制研究鲜见报道。生物信息软件预测miR-637对CTSB有调控可能,前期质谱分析发现胆管癌组织CTSB较癌旁组织表达明显增高(8.4倍),CTSB被报道在人类多种恶性肿瘤的发生、发展及转移中起着重要的作用,在胆管癌组织及血液中均高表达,与胆管癌分期、预后呈负相关。本实验设想通过实验验证miR-637是否对胆管癌细胞增殖、迁移存在调控作用,是否通过功能的和直接的靶向调控CTSB发挥对胆管癌细胞活力的抑制作用。[方法]在实验中,我们使用qRT-PCR方法检测了miR-637在胆管癌细胞系与正常胆管上皮细胞的表达,检测人类胆管癌组织相对于癌旁组织的表达。选取表达明显下调的QBC939细胞进行功能实验研究。通过慢病毒感染miR-637至胆管癌细胞QBC939,并通过荧光率验证感染效率。分别用MTT、划痕实验、流式细胞分析、Westblot来检测细胞增殖活力、细胞迁移能力、细胞凋亡、周期以及对凋亡蛋白Caspase 3与Caspase 9表达的影响。通过生物信息软件预测CTSB为miR-637可能调控的备选靶基因。使用荧光素酶报告实验验证共转染miR-637 mimics与野生型CTSB组荧光率是否较空白对照及mut组显著降低。RT-PCR和Western blot分别从基因与蛋白层面检测过表达mi R-637对CTSB的表达的影响。RT-PCR法对41例胆管癌标本的miR-637及CTSB mRNA水平进行相关性分析,进一步验证miR-637是否存在与CTSB mRNA的负性相关性。[结果]胆管癌细胞系(QBC939、RBE、HuCCT1)的miR-637水平均显著高于胆管上皮细胞(HIBEpiC),而QBC939细胞表达水平高于其他几种胆管癌细胞,胆管癌组织miR-637表达较癌旁组织显著升高。预实验发现:RT-PCR法显示胆管癌细胞QBC939 miR-637的表达丰度为低。慢病毒转染mi R-637至QBC939细胞72小时显示转染后细胞形态正常,转染效率(荧光率)70-80%。MTT实验发现过表达miR-637组胆管癌细胞的增殖活力显著下降,划痕实验显示过表达miR-637抑制了胆管癌细胞的迁移,流式细胞分析显示过表达miR-637促进了胆管癌细胞的凋亡,阻滞了胆管癌细胞周期。Westblot发现过表达miR-637促进了Caspase 3与Caspase 9的表达。通过Targetscan数据库分析得知CTSB为miR-637备选靶基因,通过荧光素酶报告实验表明:共转染野生型miR-637mimic与CTSB组较mut组与空白对照组荧光率显著降低。RT-PCR及Westblot显示过表达miR-637组细胞CTSB mRNA与蛋白表达水平均显著降低。对41例胆管癌组织的miR-637与CTSB mRNA表达行相关性分析发现:mi R-637水平与CTSB mRNA表达呈负相关。结论:mi R-637可能通过结合CTSB 5’UTR端调控CTSB的表达而抑制胆管癌细胞的增殖与活力。miR-637可能通过上调凋亡蛋白表达促进了胆管癌细胞的凋亡。综上所述,miR-637在胆管癌的病理演变中扮演重要的角色。目的:研究sh RNA对CTSB干扰效果以及Cathepsin B(CTSB)在人类胆管癌(CCA)细胞QBC939增殖、迁移、凋亡及细胞周期的作用。材料与方法:通过构建和包装CTSB-sh RNA慢病毒载体转染QBC939细胞,测定sh RNA对CTSB的感染和干扰效率,检测sh RNA干扰对QB939细胞CTSB增殖、迁移能力、凋亡以及细胞周期的影响。结果:sh RNA干扰QBC939细胞CTSB m RNA的表达较QBC939-NC细胞(空白质粒干扰细胞)显著降低。CTSB干扰导致QBC939细胞增殖及迁移能力显著降低。另外,CTSB干扰使细胞更多的停留于G0/1期,G2/M期的细胞受到阻滞。结论:CTSB对CCA细胞增殖与迁移起到重要作用。sh RNA显著抑制了CTSB的表达,从而显著降低了QBC939细胞的增殖、迁移与侵袭能力,使细胞更多的停留在G0/1期,并促进了QBC939细胞的凋亡。
【图文】：

18 iR-637 表达量最低的 QBC939 细胞进行下游. A.41 例人类胆管癌组织（T）miR-637 表达较癌旁组织（P低(*p<0.05)B.胆管癌细胞系 QBC939、RBE、HuCCT1 较上皮细胞 HIBEpiC miR-637 相对表达量显著降低(*p<0.05

感染后72小时荧光拍照，感染后细胞状态正常
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.8

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本文编号：2709920