B7-H3通过调控膀胱癌干细胞自我更新能力促进膀胱癌复发转移的研究

发布时间：2020-06-12 17:55

【摘要】：研究背景:膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,在泌尿系统肿瘤中占据导致男性死亡的第二位,手术切除肿瘤后2年内,大部分患者会发生复发和远处转移。目前针对膀胱癌的诊疗手段效果有限,复发转移仍然是严重影响膀胱癌患者预后及生活质量的主要原因。肿瘤干细胞研究的结果显示其可以解释为何在重重防护措施之下,肿瘤仍然能进展、复发、转移及出现获得性耐药。膀胱癌干细胞的靶向治疗能够为膀胱癌患者提供一种新的治疗思路,很有可能成为治愈膀胱癌的关键。B7-H3是新发现的一种T细胞辅助刺激因子,其在肿瘤免疫过程中发挥的作用尚存在争论,但其作为一种新的肿瘤相关抗原已被证实在多种上皮恶性肿瘤中异常表达,如前列腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、卵巢癌等,且已有研究证实B7-H3参与调控肿瘤生物学功能,与肿瘤的复发转移相关。本课题拟对比膀胱癌患者肿瘤病灶B7-H3表达量与复发转移之间的关系,进一步在细胞和动物水平,应用分子生物学方法研究B7-H3是否能通过调控膀胱癌干细胞功能影响膀胱癌的复发以及转移,为膀胱癌干细胞治疗探寻潜在靶点。研究目的:研究B7-H3与膀胱癌患者复发转移的关系及其对膀胱癌干细胞的影响。研究方法:1.收集156例膀胱癌患者肿瘤组织,包括72例在2年内出现复发转移、并行二次手术的膀胱癌患者(首次手术标本和二次手术标本),一半制成蜡块,一半抽提组织液。运用免疫组化(Immunohistochemistry)和酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测B7-H3在复发的膀胱癌患者与未复发的膀胱癌患者中的表达情况。2.通过免疫磁珠分选的方法利用CD44和CD20抗体标记分选得到膀胱癌细胞株T24,BIU-87和5637干细胞富集群CD20-CD44+细胞群,RT-PCR验证干细胞标志物CD44,CD20,CD133,Oct4和Bmi-1的表达,裸鼠成瘤实验通过连续稀释法验证干细胞的强大的致瘤能力,收集三对三干细胞与非干细胞进行基因测序,RT-PCR验证检测结果。3.运用B7-H3沉默慢病毒和阴参悬浮转染人膀胱癌细胞T24干细胞侧群,经过嘌呤霉素筛选得到B7-H3稳定沉默的T24 CD20-CD44+细胞(B7-H3 KD CSCs)和对照组T24 CD20-CD44+细胞(NC CSCs)。m RNA水平(RT-PCR),蛋白水平(Western Blot)和细胞荧光(Cell fluorescence)三者协同验证慢病毒悬浮转染效率。悬浮培养行肿瘤微球体形成实验及裸鼠荷瘤实验,观察B7-H3对膀胱癌干细胞自我更新、致瘤性和侵袭转移潜能的影响。4.收集荷瘤小鼠肿瘤组织提取原代细胞,进行细胞功能试验,研究B7-H3沉默干细胞所形成的肿瘤细胞的生物学特性是否与干细胞特性改变一致。结果:1.B7-H3在膀胱癌复发组阳性率达79.2%,显著高于未复发组的53.6%,P0.05。且ELISA结果显示行二次手术的复发肿瘤灶的表达量(158.26±8.13 ng/ml)明显高于首次手术标本(67.45±5.68 ng/ml),P0.05。在膀胱癌复发患者二次手术肿瘤组织中,B7-H3与干细胞标志物CD44存在共表达关系,P0.05。2.免疫磁珠分选得到的CD20-CD44+细胞群证实为膀胱癌细胞系干细胞富集群,具有自我更新和强大的成瘤性。基因芯片结果和RT-PCR验证结果共同显示在三组膀胱癌干细胞系中,B7-H3在干细胞侧群中显著高表达,P0.05。3.RT-PCR,WB和细胞荧光共同验证慢病毒转染效率,B7-H3 KD CSCs细胞B7-H3表达稳定降低约4倍,差异具有统计学意义,P0.05。悬浮培养14-21天,膀胱癌干细胞的自我更新能力在B7-H3 KD组明显减弱,NC组肿瘤微球体在肿瘤球数量、直径及生长速率方面均领先沉默组,P0.05。同时,对比NC组,B7-H3 KD组干细胞标志物表达下调,P0.05。在体实验结果显示:和对照组相比,B7-H3沉默时,干细胞形成的肿瘤灶相对较小,生长能力较弱,肝脏出现远处转移的病灶数量较少,肺脏甚至肉眼未观察到转移灶,差异具有统计学意义。4.从裸鼠移植瘤抽提原代细胞,Transwell实验结果显示B7-H3 KD组原代肿瘤细胞的侵袭转移能力明显弱于NC组原代细胞,P0.05;加入THP化疗药物处理24小时,流式结果显示NC组原代细胞表现出更强的药物耐受能力,B7-H3 KD组原代细胞凋亡增多,对药物敏感性较好。结论:B7-H3与临床膀胱癌患者复发及预后密切相关,B7-H3在膀胱癌干细胞中高表达,显著加强干细胞的自我更新能力,调控肿瘤恶性生物行为,促进膀胱癌的侵袭转移,可能通过调控干细胞功能参与膀胱癌复发和进展。靶向干预B7-H3可以作为膀胱癌干细胞治疗新的方向,为临床早期诊断膀胱癌复发高危风险及指导预后治疗提供新策略。
【图文】：

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图 1. 免疫组化检测复发膀胱癌中 B7-H3 表达，左图为低表达，右图为高表达。图 2. 免疫组化检测复发膀胱癌中 CD44 表达，左图为低表达，右图为高表达。讨论膀胱癌是全世界威胁男性健康最主要的恶性肿瘤之一，在我国也是位居男性最常见泌尿系统肿瘤的前列，其发病率和死亡率逐年上升，由于其具有易复发性，膀胱癌患者的治疗周期较长，患者承受的经济压力和心理压力均较大，给患者个人、家庭和

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图 2. 免疫组化检测复发膀胱癌中 CD44 表达，左图为低表达，右图为高表达讨论膀胱癌是全世界威胁男性健康最主要的恶性肿瘤之一，在我国也是位居男性最尿系统肿瘤的前列，其发病率和死亡率逐年上升，由于其具有易复发性，膀胱的治疗周期较长，患者承受的经济压力和心理压力均较大，给患者个人、家庭都造成了巨大的负担[52]。膀胱癌发病机制复杂，发生发展与多种因素有关，
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14

【参考文献】