miR-506在胰腺导管腺癌与胰腺正常组织中的表达研究

发布时间：2020-06-14 02:51

【摘要】：目的:胰腺导管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma,PDAC)是一种高致死率的恶性肿瘤,近年来发病率和死亡率有上升的趋势。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类短链、非编码RNA,在多种真核细胞中于转录后水平调节靶基因的表达。MicroRNA-506(miR-506)是存在于X染色体上的一种MicroRNA,通过对靶基因转录后的调控影响细胞增殖、凋亡、衰老、细胞周期、细胞分化、上皮-间质转化、血管生成、侵袭和转移等多种生命过程。关于miR-506在胰腺组织和PDAC中的表达及意义的文献较少,且相关文献均将胰腺导管、腺泡和胰岛组织作为一个整体与PDAC进行比较。由于大部分PDAC起源于导管上皮,比较miR-506在PDAC细胞和正常胰腺导管上皮中的表达水平以评估miR-506在PDAC中所起的作用将更为准确。因此,本研究拟通过两种方法检测石蜡包埋PDAC组织中miR-506的表达,并分析其与临床病理参数之间的关系,提示miR-506在PDAC发展中的作用;另外,分别检测miR-506在胰腺导管、胰腺腺泡/胰岛中的表达水平,通过比较正常胰腺组织各成分之间及其与PDAC之间的差异,提示miR-506在PDAC发生中的表达变化。方法:1、利用组织芯片(tissue microarray,TMA)和miRNA原位杂交(In Situ Hybridization,ISH)技术,结合形态学,检测miR-506在PDAC、正常胰腺导管以及腺泡/胰岛中的表达水平,并在PDAC中分析miR-506表达与临床病理参数之间的关系。2、利用激光捕获显微切割技术(Laser Capture Microdissection,LCM)和手工切割的方法,从石蜡包埋组织中分离正常的胰腺导管、腺泡/胰岛和PDAC,分别提取总RNA,逆转录后应用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR),检测miR-506的表达情况,并分析PDAC中miR-506表达与临床病理参数之间的关系。3、比较miRNA ISH与qRT-PCR检测结果,明确miR-506在胰腺正常组织及PDAC中的表达特点,并分析两种方法在检测石蜡包埋组织中miRNA表达水平的优缺点。结果:1、在110例PDAC中完成了TMA基础上的miR-506 ISH,结果显示,miR-506在72例(65.5%)和38例(34.5%)PDAC中分别呈高表达和低表达。并且,在T3和T4期、低分化和发生淋巴结转移的PDAC中miR-506的表达水平分别明显低于T2期(P=0.004)、高-中分化(P=0.023)和未发生淋巴结转移(P=0.033)的PDAC,而年龄(P=0.139)、性别(P=0.127)、肿瘤原发部位(P=0.213)、肿瘤大小(P=0.638)、血管侵犯(P=0.595)及临床分期(P=0.063)与miR-506的表达无统计学差异。在100例PDAC石蜡包埋组织中完成了miR-506的qRT-PCR检测。对100例PDAC临床病理参数进行统计分析,结果显示肿瘤直径4cm、T3和T4期的PDAC中miR-506的表达水平分别明显低于肿瘤直径≤4cm(P=0.04)、T2期(P=0.023)的PDAC,而年龄(P=0.229)、性别(P=0.417)、部位(P=0.21)、分化程度(P=0.305)、血管侵犯(P=0.295)、淋巴结转移(P=0.401)以及临床分期(P=0.389)与miR-506的表达无统计学差异。2、对TMA上的87例正常胰腺组织进行了miR-506 ISH检测,结果显示,miR-506在9.6%(7/73)和90.4%(66/73)的正常胰腺导管上皮中呈高表达和低表达,在68.3%(45/66)和32.7%(21/66)的正常胰腺组织的腺泡/胰岛中呈高表达和低表达;与第一部分在PDAC中的检测结果相比,miR-506在PDAC中的表达水平高于胰腺的正常导管(P0.001),但低于正常的胰腺腺泡/胰岛(P0.001)。对100例PDAC和17例正常胰腺组织的腺泡/胰岛和导管进行LCM和手工切割,qRT-PCR结果显示,在8%(8/100)和92%(92/100)的PDAC中miR-506的表达分别高于和低于正常胰腺导管上皮,在6%(6/100)和94%(94/100)的PDAC中miR-506的表达分别高于和低于正常胰腺组织的腺泡/胰岛。对10例配对的PDAC及其正常胰腺组织进一步分析,结果显示,与配对的正常胰腺导管和胰腺腺泡/胰岛相比较,miR-506在PDAC中均呈低表达(P0.0001)。3、在PDAC中,miR-506 ISH与qRT-PCR的结果基本一致,miR-506高表达均更多地见于较低的T分期。在PDAC与正常胰腺组织不同成分的比较中,miR-506ISH与qRT-PCR的结果不同。出现差异的原因可能有:一、样本量较小。二、miR-506 ISH在TMA上完成,正常组织中的胰腺导管数量非常少。三、评估miRNA ISH结果采用了半定量的方法,根据染色强度和阳性细胞比例的乘积进行评分,与qRT-PCR的定量分析不同。四、最重要的可能是miR-506位于细胞浆中,与正常导管相比,PDAC的细胞核/浆比例变大,细胞浆较少,浆内的miRNA相对浓度大,染色深,视觉上表达更强,结果评判受主观影响更大。五、miRNA ISH试剂盒建议的内参为U6,表达于细胞核,与表达于细胞浆的miR-506的匹配性存在疑问。qRT-PCR虽然不能直接与组织形态学相结合,但借助LCM/手工切割获得特定组织成分,通过定量检测得到的结果更可信。结论:1、鉴于miRNA受组织降解的影响比较小,在福尔马林固定、石蜡包埋组织中通过qRT-PCR的方法检测miRNA的表达是可行的。通过LCM/手工切割获得特定的组织成分进行qRT-PCR,可以弥补qRT-PCR不能兼顾组织学的劣势。2、虽然miRNA ISH能够与形态学相结合,但是通过染色强度进行半定量评估所得的结果在精确度上低于qRT-PCR。选择合适的研究对象、发现并使用更合理的内参、增大样本量可能会提高miRNA ISH的检测效力。3、建立在LCM和手工切割基础上的qRT-PCR结果证实,miR-506在PDAC中的表达明显低于正常胰腺导管上皮,并且其表达水平与PDAC预后不良因素呈负相关,提示miR-506低表达可能与PDAC的发生发展有关,但仍需大样本研究及体外实验和动物实验证实。 【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9

【图文】：

芯片,低分化,高分化,石蜡包埋

组织芯片 HE 染色图片。200 例福尔马林固定、石蜡包埋的胰腺 113 例 PDAC 组织和 87 例切缘的正常胰腺组织，分布于 5 个组进一步分析了 110 例 PDAC 中 miR-506 的表达水平与肿瘤分化之在高分化和中分化（低级别）的 PDAC 中，更多的病例表现为 m而在低分化（高级别）的 PDAC 中，miR-506 常为低表达（图：PDAC 呈高、中分化的样本中，miR-506 低表达的有 39 例（57. 29 例（42.6%）；而低分化的 PDAC 中，miR-506 低表达的有，高表达的仅有 9 例（21.4%）。统计学分析结果显示，在高分化AC 中 miR-506 高表达例数的比例显著高于低分化的 PDAC 中的）。

级别,代表性,图像,患者

171.2 在不同分化级别的 PDAC 中 miR-506 ISH 的代表性图像。miR-506 ISH 在A 上完成，并以 U6 作为内参。TMA 连续切片，分别进行 HE 染色、U6 ISHmiR-506 ISH。miR-506 ISH 显示，在这例高-中分化 PDAC 中 miR-506 的表达低分化的 PDAC。标尺为 200μm。另外，T1、T2 期的患者样本中，miR-506 低表达的有 12 例（42.9%），高表有 16 例（57.1%）；T3、T4 期的患者样本中，miR-506 呈低表达的有 60 例3.2%），高表达的有 22 例（26.8%）。统计学分析结果显示，T1、T2 期 PDACmiR-506 高表达的比例显著高于 T3、T4 期病例（P=0.004）。在发生淋巴结转

【相似文献】