RCC2对乳腺癌病变的作用及其分子机制的研究

发布时间：2020-06-16 16:03

【摘要】：研究背景:染色体浓缩调节因子 2(Regulator of chromosome condensation 2,RCC2)也称作TD60,位于染色体1p36.13位点。其编码的蛋白质属于染色体乘客复合体(chromosomal passenger complex,CPC)的一员,参与细胞有丝分裂和纺锤体的组装,并与细胞的定向迁移有关。肿瘤重要的病理特征就是细胞异常增殖和细胞转移。有研究报道,RCC2与肿瘤发病有关,在肿瘤发病过程中发挥作用。例如,有报道称RCC2与黑色素瘤及皮肤基底细胞癌的复发相关;RCC2表达在胃癌组织中显著上调,并在临床上可用于筛选结直肠癌高危病人;RCC2表达能促进非小细胞肺癌的转移等。以上种种证据说明RCC2表达是肿瘤发病过程中的重要因素。乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,它的发生率占女性恶性肿瘤总数的30%,并且近几年有不断上升的趋向。肿瘤细胞的生物学行为如增殖、迁移、凋亡关系到乳腺癌的发展及预后,与肿瘤致癌基因、抑癌基因信号通路异常密切相关,但确切的分子机制尚未完全了解。因此,探究乳腺癌相关的细胞及分子机制、寻找有效的诊断、预后标志物和治疗靶点对诊断乳腺癌及判断预后具有十分重要的作用。RCC2被发现与多种癌症病变有关使我们推断RCC2可能也与乳腺癌相关,但至今尚未有关于RCC2对乳腺癌作用的体外和体内研究报道。因此,本课题计划研究RCC2在乳腺癌组织中的表达及作用机制。雌激素受体阳性型乳腺癌为乳腺癌中最常见的类型。因此在探究RCC2与乳腺癌的致病及其调控机制的同时,我们也研究雌激素在乳腺癌中扮演的重要角色及是否通过RCC2发挥作用。本研究通过从临床乳腺组织标本、培养乳腺癌细胞模型及乳腺癌荷瘤动物模型三个方面探索RCC2在乳腺癌中的致病机制,阐明RCC2对乳腺癌病变的作用,为进一步阐明乳腺癌发病机制提供新的思路。方法:1.收集乳腺组织标本32例,其中雌激素受体阳性(Estrogen receptor positive,ER+)乳腺癌组织16例,雌激素受体阴性(Estrogen receptor negative,ER-)乳腺癌组织9例,乳腺纤维瘤组织7例。提取总蛋白,用western blot检测不同类型乳腺组织RCC2的蛋白表达水平。2.以最常见的乳腺癌细胞系MCF-7(ER+)为细胞模型,用瞬时转染方法将特异的小干扰RNA(si-RCC2)导入细胞抑制RCC2的表达,也用瞬时转染方法将过表达质粒(pcDNA3.1-RCC2-RFP)导入细胞使RCC2过表达,用Real-time PCR和western blot检测RCC2在mRNA及蛋白水平的表达。观察RCC2的改变对细胞增殖、细胞迁移以及细胞凋亡的影响。3.用瞬时转染法抑制RCC2在MCF-7细胞内表达后,以无意义小干扰片段转染的 MCF-7 细胞为对照组,采用 PAHS-131ZA Human Breast Cancer RT2 ProfilerTM PCR Array芯片观察乳腺癌相关信号通路中84个相关基因表达量有无明显变化。用Real-time PCR和Western blot分别在mRNA及蛋白水平验证变化趋势,筛选RCC2可能调控的下游基因。4.由吉玛公司制备可抑制RCC2表达的慢病毒和空载慢病毒,用稳定转染的方法分别将两种慢病毒导入乳腺癌细胞系MCF-7。选用4-5周雌性裸鼠BALB/C Nude,皮下注射抑制RCC2表达的慢病毒稳转乳腺癌细胞系MCF-7,构建裸鼠皮下成瘤模型。同时以空载慢病毒稳转乳腺癌细胞系MCF-7作为对照组。测量肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线,磁共振成像技术检测肿瘤表观弥散系数(Apparent Diffusion Coefficient,ADC),称量瘤体重量,以观察RCC2表达的改变对裸鼠皮下瘤体生长的影响。5.用不同浓度雌激素处理培养MCF-7细胞。观察不同浓度雌激素对RCC2基因蛋白表达的影响。用最佳浓度10-8mol/L雌激素处理培养MCF-7细胞。观察雌激素对PCR Array芯片筛选出的RCC2下游基因即碱性螺旋-环-螺旋转录因子1(Twist Family BHLH Transcription Factor 1,TWIST 1)和胰岛素样生长因子 1(Insulin-Like Growth Factor 1,IGF1)mRNA及蛋白表达的影响。观察雌激素与RCC2共同作用于MCF-7细胞时对细胞增殖及凋亡的影响。结果:1.ER+乳腺癌组织(n=16)、ER-乳腺癌组织(n=9)及乳腺纤维瘤组织(n=7)各组间RCC2蛋白表达水平差异有统计学意义(F=9.497,P=0.001)。多重比较显示,乳腺纤维瘤组织(0.284±0.085)与ER+乳腺癌组织(0.795±0.342)和ER-乳腺癌组织(0.569±0.153)相比RCC2蛋白表达水平均低(P0.001,P=0.039),且ER+乳腺癌组织比ER-乳腺癌组织RCC2蛋白表达水平高(P=0.048)。说明RCC2在乳腺癌组织中呈高表达,且在ER+乳腺癌组织中RCC2表达量高于ER-乳腺癌组织。2.与无意义小干扰片段处理的对照组相比,小干扰RNA(si-RCC2)成功在mRNA及蛋白水平上抑制MCF-7细胞内RCC2的表达(P=0.019,P=0.017)。与空载质粒处理的对照组相比,过表达质粒成功使MCF-7细胞RCC2表达量升高(P0.001)。抑制RCC2的表达后MCF-7细胞迁移能力明显减弱(P4day=0.004),细胞凋亡比例明显增加(P=0.037),但细胞增殖无明显变化(F处理=0.003,P=0.957);过表达RCC2可使MCF-7细胞迁移能力明显增强。(P4day=0.009),细胞凋亡比例明显减少(P=0.037),但细胞增殖无明显变化(F处理=2.304,P=0.149)。说明RCC2表达可促进MCF-7细胞迁移,抑制MCF-7细胞凋亡。3.MCF-7细胞内抑制RCC2表达后,与无意义小干扰片段处理的对照组相比PAHS-13]ZA Human Breast Cancer RT2 ProfilerTM PCR Array 芯片共筛查出 3 个表达量变化≥2倍的基因。其中IGF1表达下调2.60倍,神经迁移因子2(Slit Guigance Ligand 2,SLIT2)表达上调 223 倍,TWIST1 表达下调 2.53 倍。Real-time PCR证实在抑制RCC2表达后,TWIST1及IGF 1的mRNA表达水平下降(P=0.019,P=0.013),与 PCRArray 结果一致;而 SLIT2 的 mRNA 表达水平在抑制RCC2表达前后无明显变化(P=0.832)。继续用western blot验证,发现抑制RCC2表达后,TWIST1及IGF1蛋白表达水平均显著下降,分别下降约46.3%和35.9%(P=0.036,P=0.007)。说明RCC2正向调控人乳腺癌信号通路中的TWIST1和IGF1基因。4.皮下注射抑制RCC2表达的慢病毒稳转乳腺癌细胞系MCF-7,成功构建裸鼠皮下成瘤模型。与空载慢病毒处理的对照组裸鼠相比,用抑制RCC2表达的慢病毒稳转乳腺癌细胞系MCF-7细胞构建的裸鼠肿瘤生长缓慢,瘤体体积减小(P=0.002),瘤体重量减小(P=0.001),ADC值升高(P=0.044),说明抑制MCF-7细胞内RCC2的表达可延缓裸鼠皮下肿瘤的生长。5.与含0.1%乙醇处理的对照组相比,104-10-12mol/L浓度范围内雌激素可促进MCF-7细胞表达RCC2,且在雌激素浓度为10-8mol/L时RCC2蛋白表达量最高。与含0.1%乙醇处理的对照组相比,10-8mol/L雌激素也可促进PCRArray芯片筛选出的乳腺癌信号通路相关基因TWIST1和IGF1在MCF-7细胞的表达(P=0.018,P=0.046),蛋白水平分别升高约1.90倍及1.34倍。与含0.1%乙醇处理的对照组相比,雌激素本身促进细胞增殖(P0.001),但在雌激素存在下RCC2表达量的改变对细胞增殖无明显影响(P=0.200,P=0.101);在雌激素存在的情况下抑制RCC2的表达时细胞凋亡率增加(P=0.020),促进RCC2的表达时细胞凋亡率下降(P=0.019)。说明雌激素通过RCC2正向调控IGF1和TWIST1的表达从而促进肿瘤生长。结论:1.RCC2在乳腺癌组织中呈高表达,且在ER+乳腺癌组织中RCC2表达量高于ER-乳腺癌组织。2.RCC2表达可促进MCF-7细胞迁移,抑制MCF-7细胞凋亡。3.RCC2正向调控人乳腺癌信号通路中的TWIST1和IGF1基因。有报道,TWIST1有诱导细胞迁移、侵袭以及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用,IGF1在细胞增殖、分化及抑制凋亡方面有重要作用。4.裸鼠皮下成瘤模型中抑制慢病毒稳转细胞系MCF-7内RCC2的表达延缓裸鼠皮下肿瘤生长。5.雌激素通过RCC2正向调控IGF1和TWIST1的表达从而促进肿瘤生长。上述结果建议RCC2是乳腺癌致癌基因,雌激素通过刺激RCC2表达及其下游TWIST1和IGF1表达来抑制细胞凋亡和促进细胞转移。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

乳腺组织,蛋白表达,乳腺癌组织,条带

图１．邋ＲＣＣ２在乳腺组织中的蛋白表达。逡逑（Ａ）逦Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测ＥＲ＋乳腺癌组织目的蛋白条带。逡逑（Ｂ）逦Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测ＥＲ－乳腺癌组织目的蛋白条带。逡逑（Ｃ邋）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测乳腺纤维瘤组织目的蛋白条带。逡逑（Ｄ）用ＩｍａｇｅＪ软件将ＲＣＣ２蛋白表达量化并用内参ＧＡＰＤＨ校准后的相对蛋逡逑白表达程度。＊Ｐ＜0．0５；邋＊＊＊Ｐ＜０．００１。逡逑

过表达,蛋白表达,细胞转染,质粒

图２．转染ｓｉ－ＲＮＡ／过表达质粒后，ＭＣＦ－７细胞ＲＣＣ２的ｍＲＮＡ、蛋白表达水逡逑平。逡逑（Ａ）逦Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测ＭＣＦ－７细胞转染ｓｉ－ＲＮＡ７２ｈ后ＲＣＣ２的蛋白表达。逡逑（Ｂ）逦Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测ＭＣＦ－７细胞转染过表达质粒７２ｈ后ＲＣＣ２的蛋白表达。逡逑（Ｃ邋）实时荧光定量ＰＣＲ检测ＭＣＦ－７细胞转染ｓｉＲＮＡ邋４８ｈ后ＲＣＣ２的ｍＲＮＡ逡逑表达。＊Ｐ＜０．０５ｖｓ邋Ａｌｌｓｔａｒｓ－ｓｉＲＮＡ邋组。逡逑（Ｄ）实时荧光定量ＰＣＲ检测ＭＣＦ－７细胞转染过表达质粒４８ｈ后ＲＣＣ２的ｍＲＮＡ逡逑表达。＊＊＊尸＜０．００１ｖｓＯ－ＲＦＰ邋组。逡逑

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