【摘要】：第一部分肿瘤浸润淋巴细胞在胃癌中的浸润与临床病理参数及预后的关系背景:胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率逐年升高,目前治疗方法主要为外科切除肿瘤后进行放化疗辅助治疗。近年肿瘤免疫疗法取得突破,肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)作为肿瘤微环境(TME)中主要免疫细胞的作用尤为重要,但TIL在各肿瘤中的浸润存在异质性并与患者预后有关。目前,胃癌领域中TIL浸润情况及其与临床病理参数和患者预后间的关系模式尚未建立。目的:检测TIL在胃癌组织中的浸润程度,分析其浸润与临床病理参数的关系和对胃癌术后患者总生存期(overall survival,OS)的影响,评估其与胃癌患者预后的关系。方法:回顾性队列分析苏州大学附属第三医院2002年1月至2008年12月总计1033例胃癌术后患者病例,由两名资深病理学医师阅片诊断并评估HE染色切片中TIL组织学评分。记录临床资料,进行χ2检验、Kaplan-Meier生存分析、Cox回归分析和构建nomogram模型等分析TIL浸润与临床病理参数及患者OS的关系,分析影响肿瘤进展风险的因素。结果:分析HE切片发现,TIL的组织形态在不同病例中具有异质性,在1033例病例中TIL高浸润组532例(51.5%)。统计分析结果显示,TIL浸润与肿瘤大小、TNM分期、病理分级、LN转移、神经侵犯和脉管内癌栓的差异有显著的统计学意义(P0.001)。生存分析结果显示TIL高浸润为胃癌术后患者预后的正性预测因子,其高浸润的患者平均OS为78.73月,低浸润患者平均生存期为42.81月(χ2=174.77,P0.001),TNM I-III分期中TIL高浸润的患者都具有良好的预后(P0.001)。多因素Cox分析表明:50岁以上胃癌患者比50岁以下患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.897,95%CI:1.437-2.504,P0.001);肿瘤大小超过5cm的胃癌患者比小于5cm患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.224,95%CI:1.014-1.478,P=0.035);淋巴结转移胃癌患者比未见淋巴结转移患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.509,95%CI:1.080-2.110,P=0.016);可见神经侵犯胃癌患者比未见神经侵犯患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.308,95%CI:1.073-1.595,P=0.008);TNM分期增高胃癌患者比低分期患者的肿瘤进展风险更高(TNM II stage:HR=2.519,95%CI:1.583-4.009,P0.001,TNM III stage:HR=4.702,95%CI:2.769-7.984,P0.001);TIL低浸润胃癌患者比高浸润患者的肿瘤进展风险更高(HR=0.464,95%CI:0.384-0.561,P0.001)。随后根据多因素Cox回归模型确定的独立性预后因素构建Nomogram模型,模型C-指数为0.77,TNM分期C-指数为0.72,TIL浸润C-指数为0.65,与TNM分期系统或TIL浸润程度相比nomogram模型预测患者OS的精确度更高。结论:TIL浸润与用于评估肿瘤恶性程度、肿瘤转移的临床病理参数呈显著负相关,是胃癌术后患者预后的正性预测因子,并且在多因素Cox回归模型中为具有保护作用的独立性预后因素。利用TIL和患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、神经侵犯、TNM分期构建的nomogram模型与TNM分期相比包含了TME中免疫作用的因素,因此可更全面的反映患者信息,更好的预测患者预后。第二部分三级淋巴结构在胃癌中的表达与临床病理参数及预后的关系背景:TME是肿瘤发生发展的内环境,包括肿瘤细胞组成的肿瘤实质,还包括肿瘤间质成分,比如间质支持细胞、血管和不同的免疫细胞群,反映着机体与肿瘤对抗的状态。作为肿瘤的生存环境,其中不仅包含异位浸润的TIL,还含有形成的三级淋巴结构(TLS)。而TLS具有与二级淋巴器官类似的功能,通过趋化因子、细胞因子等招募幼稚T、B细胞至TME内,并活化发挥相应的免疫功能。然而TLS在胃癌组织内的形成情况及与患者预后的关系仍不明确。目的:检测TLS在胃癌组织中的表达,分析其表达与临床病理参数的关系和对胃癌术后患者OS的影响,评估其与胃癌患者预后的关系。方法:回顾性队列分析苏州大学附属第三医院2002年1月至2008年12月总计1033例胃癌术后患者病例,由两名资深病理学医师阅片诊断并评估HE染色切片中TLS组织学评分。记录临床资料,进行χ2检验、Kaplan-Meier生存分析、Cox回归模型等分析TLS表达与临床病理参数及患者OS的关系,分析影响肿瘤进展风险的因素。结果:分析HE切片发现,TLS在1033例病例中高表达组631例(61.1%)。统计分析结果显示,TLS表达与肿瘤大小和LN转移的差异有显著的统计学意义(P0.05)。生存分析结果显示TLS高表达为胃癌术后患者预后的正性预测因子,其高表达的患者平均OS为62.27月,低表达患者平均生存期为55.70月(χ2=11.272,P=0.001)。TNM I期和II期的患者中TLS高表达组具有良好的预后(P=0.045,P=0.003),TNM III期患者中TLS表达与患者预后没有统计学差异(P=0.165)。多因素Cox分析表明:50岁以上胃癌患者比50岁以下患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.859,95%CI:1.408-2.454,P0.001);高级别胃癌患者比中低级别患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.344,95%CI:1.092-1.654,P=0.005);淋巴结转移胃癌患者比未见淋巴结转移患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.570,95%CI:1.127-2.189,P=0.008);可见神经侵犯胃癌患者比未见神经侵犯患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.415,95%CI:1.161-1.726,P=0.001);可见脉管内癌栓胃癌患者比未见癌栓患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.203,95%CI:1.007-1.438,P=0.042);TNM分期增高胃癌患者比低分期患者的肿瘤进展风险更高(TNM II stage:HR=2.158,95%CI:1.580-4.011,P0.001,TNM III stage:HR=5.132,95%CI:3.039-8.666,P0.001);TLS低表达胃癌患者比高表达患者的肿瘤进展风险更高(HR=0.755,95%CI:0.634-0.900,P=0.002)。结论:TLS表达与用于评估肿瘤转移的临床病理参数呈显著负相关,是胃癌术后患者预后的正性预测因子,并且在多因素Cox回归模型中为具有保护作用的独立性预后因素。TLS主要影响TNM分期I-II期患者的预后,即早期和中期肿瘤患者中TLS高表达具有良好的预后,晚期肿瘤患者TLS表达与预后不具有统计学关系。第三部分联合亚组分析TIL和TLS与胃癌患者预后的关系背景:TIL和TLS在多种实体性肿瘤中的表达都与患者预后情况相关。课题组前期工作也证明TIL和TLS的表达与胃癌患者OS相关并是独立性预后因素。TIL反映免疫细胞浸润情况,TLS反映淋巴细胞器官样结构的形成,TIL内细胞成分可以促进TLS的形成而TLS可以招募免疫细胞异位浸润至肿瘤局灶。但是两者间联合的表达情况及对患者预后的影响仍缺乏进一步验证。目的:分析胃癌组织内TIL和TLS表达的差异及相关性。联合亚组分析TIL和TLS(TIL-TLS)的表达与临床病理参数的关系和对胃癌术后患者OS的影响,评估其与胃癌患者预后的关系和临床指导意义。方法:根据前述TIL和TLS组织学评分数据进行统计学分析两者的相关性,随后亚组分型后进行χ2检验、Kaplan-Meier生存分析、Cox回归模型分析胃癌中TIL-TLS的表达与临床病理参数及患者OS的关系,分析影响肿瘤进展风险的因素。结果:根据TIL和TLS组织学评分数据进行统计分析后发现两者在胃癌组织内表达具有显著的统计学差异并具有相关性(χ2=34.547,P0.001,r=0.192,P0.001)。根据TIL-TLS双高表达将1033例病例分组为TIL-TLS高表达组371例(35.9%),TIL-TLS低表达组662例(64.1%)。TIL-TLS表达与胃癌患者的肿瘤大小、TNM分期、病理分级、LN转移、神经侵犯和脉管内癌栓的差异有显著的统计学意义(P0.001)。生存分析结果显示TIL-TLS高表达为胃癌术后患者预后的正性预测因子,其高表达的患者平均OS为80.72月,低表达患者平均OS为50.78月(χ2=101.484,P0.001),TNM I-III期患者中高表达组具有良好的预后(P=0.001,P0.001,P0.001)。多因素Cox分析表明:50岁以上胃癌患者比50岁以下患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.023,95%CI:1.014-1.032,P0.001);高级别胃癌比中低级别胃癌患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.232,95%CI:1.002-1.516,P=0.048);淋巴结转移胃癌患者比未见淋巴结转移患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.522,95%CI:1.088-2.129,P=0.014);可见神经侵犯胃癌患者比未见神经侵犯患者的肿瘤进展风险更高(HR=1.322,95%CI:1.084-1.613,P=0.006);TNM分期增高胃癌患者比低分期患者的肿瘤进展风险更高(TNM II stage:HR=2.461,95%CI:1.526-3.967,P0.001,TNM III stage:HR=5.021,95%CI:2.918-8.639,P0.001);TIL-TLS低表达胃癌患者比高表达患者的肿瘤进展风险更高(HR=0.467,95%CI:0.378-0.578,P0.001)。结论:胃癌组织内TIL与TLS的表达具有相关性。TIL-TLS高表达与用于评估肿瘤进展和转移情况的临床病理参数呈显著负相关,为胃癌术后患者预后的正性预测因子,是理想的组合性预测因子。TNM I-III期的TIL-TLS高表达组患者具有良好的预后。在多因素Cox回归模型中为具有保护作用的独立性预后因素。第四部分TME内淋巴细胞亚型分析背景:TME作为肿瘤内生环境,对肿瘤发生发展起到重要作用。TIL和TLS是TME内淋巴细胞的主要构成和组织结构,其内所含的淋巴细胞亚型直接影响两者的免疫功能。目前对TIL或TLS内细胞亚型的研究也有报道,但是针对胃癌组织内淋巴细胞亚型分布情况仍有待研究。目的:通过免疫组化标记TME内淋巴细胞亚型,验证TIL和TLS组织学评分的准确性。观察三级淋巴结构生发中心内的CD8+T细胞(gc CD8+TIL)的表达情况,统计分析其与临床病理参数的差异和对胃癌术后患者OS的影响。将TIL、TLS、TIL-TLS和gc CD8+TIL定义为免疫浸润参数并评估其与胃癌患者预后的关系和临床指导意义。方法:随机选取苏州大学附属第三医院2006年至2008年间的63例胃癌术后患者病例,通过HE染色切片由两名资深病理学医师阅片诊断并评估TIL和TLS组织学评分。随后进行CD3、MECA79和CD8的免疫组化染色并评估免疫组化染色结果。使用χ2检验和一致性检验评估CD3+TIL表达与TIL组织学评分的准确性。使用χ2检验和相关性检验评估MECA79表达与TLS表达的相关性及TLS组织学评分的准确性。使用χ2检验和Kaplan-Meier生存分析、Cox回归模型等分析免疫浸润参数与临床病理参数及患者OS的关系,分析影响肿瘤进展风险的因素。结果:63例胃癌患者分组情况为:TIL高浸润组44例(69.8%);TLS高表达组43例(68.3%);TIL-TLS高表达组32例(51.8%);MECA79高表达组40例(63.5%);CD3+TIL高表达组43例(68.3%);gc CD8+TIL高表达组23例(35.9%)。CD3+TIL与TIL组织学评分的差异具有统计学意义(χ2=27.94,P0.001),并且具有一致性(κ=0.666,P0.001)。MECA79与TLS组织学评分的差异具有统计学意义(χ2=10.262,P=0.001),并且具有相关性(r=0.389,P=0.002)。TIL与肿瘤大小、神经侵犯、LN转移、病理分级和TNM分期的差异具有统计学意义。TLS与各项临床病理参数之间没有统计学差异。TIL-TLS与神经侵犯、脉管内癌栓、LN转移、病理分级的差异具有统计学意义。gc CD8+TIL与患者年龄、病理分级和TNM分期的差异具有统计学意义。在Kaplan-Meier生存分析中,TIL、TLS、TIL-TLS和gc CD8+TIL为胃癌术后患者预后的正性预测因子,与胃癌患者OS显著相关(P=0.001,P=0.011,P0.001,P0.001)。TNM III期患者中gc CD8+TIL高表达组具有良好的预后(P=0.002)。为了对比免疫浸润参数对患者OS的综合影响,按照免疫浸润参数组合的不同进行了多组多因素Cox回归模型分析。将TIL、TLS、gc CD8+TIL与临床病理参数进行多因素Cox回归分析,结果显示gc CD8+TIL是独立性预后因素(HR=0.087,95%CI:0.011-0.692,P=0.021);将TIL-TLS、gc CD8+TIL与临床病理参数进行多因素Cox回归分析,结果显示TIL-TLS(HR=0.247,95%CI:0.069-0.882,P=0.031)和gc CD8+TIL(HR=0.067,95%CI:0.008-0.561,P=0.013)是独立性预后因素;单独对免疫浸润参数TIL、TLS和gc CD8+TIL进行多因素Cox模型,结果显示TIL(HR=0.322,95%CI:0.124-0.835,P=0.020)和gc CD8+TIL(HR=0.059,95%CI:0.008-0.451,P=0.006)是独立性预后因素。结论:经CD3、MECA79免疫组化染色验证TIL和TLS组织学评分是准确可行的。gc CD8+TIL与多种提示肿瘤进展快预后不良的临床病理参数呈显著负相关,是胃癌术后患者预后的正性预测因子,尤其晚期胃癌患者中gc CD8+TIL高表达组具有良好的预后。免疫浸润参数与评估肿瘤转移指标的临床病理参数呈显著负相关,是理想的组合性预测因子。在多因素Cox模型中,免疫浸润参数是具有保护作用的独立性预后因素,其中gc CD8+TIL和TIL-TLS的保护作用最强。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：
图 1-1. 胃癌组织内 TIL 浸润 形成生发中心样结构（×100, ×400）；CD：粘液腺癌中 TIL 围绕在粘乳头状癌中 TIL 分布在纤维血管轴心中（×100, ×400）；GH：TIL 围00）；IJ：TIL 与癌组织相互交织（×100, ×400）。I J
胃癌样本中TIL浸润的ROC曲线
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