肺腺癌患者液体活检中肿瘤细胞的鉴定与表征研究

发布时间：2020-06-17 20:29

【摘要】：研究背景与目的:循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells;CTC)是液体活检中一个重要的组成部分。目前CTC检测方法基本都遵循了“先富集后鉴定”的两步原则,但遗憾的是,富集过程通常繁琐且导致CTC的损失,而且由于缺乏肿瘤特异性标志物因此难以有效的鉴定一个细胞是否确实为肿瘤细胞,这为CTC检测的可靠性带来了很大的挑战。肿瘤细胞能量代谢异常是肿瘤的普遍性特征之一,对于葡萄糖摄取高于一定阈值的组织就可被鉴定为恶性肿瘤组织。因此我们提出了一种通过肿瘤细胞能量代谢异常来鉴定CTC的方案,即:通过一种荧光标记的葡萄糖类似物来检测液体样本中所有有核细胞的葡萄糖摄取;同时考虑到肿瘤还存在其他代谢途径,利用其他碳源作为能量来源,因此我们还尝试了将氧化还原代谢标志物与葡萄糖代谢标志物联合使用鉴定CTC,以实现更高的检测灵敏度。通过这一高通量方法能够快速在海量细胞中找到高代谢活性的疑似肿瘤细胞,由于是功能检测因此不损害细胞活性,不会影响单细胞基因组扩增从而干扰测序结果,并且可以进行RNA检测。最后为了验证这一方法的准确性,疑似肿瘤细胞最终通过单细胞测序加以确认。研究方法及结果:第一部分:我们制作了可寻址微孔的芯片,通过荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG、白细胞标志物CD45、死细胞染料EthD-1,在肺癌患者的胸水样本、血液样本中标记;通过高内涵成像系统对芯片中的细胞进行快速成像与分析,鉴定出疑似的肿瘤细胞;最后通过显微操作,提取单细胞进行测序,并与原位组织的驱动基因情况进行比较,确认其可靠性。结果表明:在10例已知驱动基因肺癌患者的胸水样本中,均检测到具有高代谢活性的疑似肿瘤细胞,所有患者的单细胞测序发现驱动基因突变,因此可以确认该细胞即为肿瘤细胞。然后我们在2例已知驱动基因突变状态患者的血液样本中,用类似的方法,找到高代谢的肿瘤细胞,并通过单细胞测序加以确认。第二部分:通过第一部分类似的细胞捕捉与标记的方法,我们用另外一种氧化还原指示剂刃天青(Resazurin)和葡萄糖类似物2-NBDG同时在肺癌患者的胸水样本中标记肿瘤细胞,结果表明:26例肺腺癌患者的胸腔积液中,用两组代谢物标记物标记的疑似肿瘤细胞群并不完全一致;肺癌患者的胸腔积液中除了有高葡萄糖代谢的肿瘤细胞之外,还存在一部分低葡萄糖摄取却具有高度刃天青活性的肿瘤细胞,并且所有的细胞均通过单细胞测序确认为肿瘤细胞;这两群有不同代谢标记的细胞可能有不同的生物学表征。研究结论:我们研究表明:基于细胞代谢活性的这一高通量方法简便、快速;可以在短时间内检测大量细胞,减少稀少肿瘤细胞丢失的可能,同时极大的简化了检测流程并降低了成本;用氧化还原指示剂刃天青(Resazurin)和葡萄糖类似物2-NBDG两种代谢标志物的协同使用能够进一步提高恶性胸腔积液的检测灵敏度。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

的十大基本特征（图 4），其中包括：维持增殖信号通路，逃避生长抑制，抑胞死亡，无限自我复制，诱导血管生成，激活浸润转移，避免免疫杀伤，促进炎症，能量代谢异常以及基因组不稳定等。这些基本特征是恶性细胞独有的，中除了能量代谢异常外，其他特征却难以方便地在单细胞程度上进行高通量测。

- 30 -图 1-1：图中为直径为 25μm 的芯片，大概可以容纳 14 万个细胞，共包含 400 个编号区域，其中每个编号区域包含 277 个 25um 直径的微孔。Fig1-1：Amicrowell chip has 140,000 microwells with a diameter and the height of 25 μm, a totalof 400 numbered regions, each of which contains 277 micropores1.4.2 2-NBDG/ EthD-1/CD45 检测结果我们选择非肿瘤患者作为对照，用于比较 2-NBDG 摄取情况在白细胞与 A549细胞中是否存在差异。我们从上海交通大学附属胸科医院获取 3 名非肿瘤患者的血液样本，CD45-APC 抗体标记血液中的白细胞。结果可以发现：经过 2-NBDG

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本文编号：2718120