EML4-ALK对非小细胞肺癌PD-L1表达的调控作用研究

发布时间：2020-06-19 05:13

【摘要】：背景和目的:有研究指出非小细胞肺癌PD-L1的表达和肺癌驱动基因EGFR有关,并受EGFR调控。EML4-ALK作为EGFR之外的最重要的NSCLC致癌驱动基因,其和NSCLC中PD-L1的表达之间的相关性和分子作用机制尚不明确。本研究旨在探讨非小细胞肺癌PD-L1表达与EML4-ALK之间的相关性,明确PD-L1在NSCLC中的表达特点和临床意义,进一步研究EML4-ALK对PD-L1表达的调控作用和潜在机制。材料和方法:1.收集2011年2月-2014年12月在天津医科大学肿瘤医院接受根治性手术切除病理分期Ⅰ-Ⅲ期的EGFR野生型肺腺癌组织141例(所有组织均在天津医科大学肿瘤医院病理科接受ALK D5F3 Ventana IHC检测),采用免疫组化的方法检测癌组织PD-L1表达情况,分析其与ALK表达之间的关系,并进一步探讨PD-L1表达与肺腺癌患者的临床病理特征和预后的关系。2.应用Western Blot、RT-PCR、细胞免疫荧光检测正常人肺支气管上皮细胞系Beas-2B、人ALK阴性非小细胞肺癌细胞系A549、GLC-82,人ALK阳性肺腺癌细胞系H2228、H3122的PD-L1表达情况,选取细胞系Beas-2B、H3122进行后续实验。3.选择ALK抑制剂TAE684及3种不同的ALK siRNA处理H3122细胞系,同时设置阴性对照组;选择EML4-ALK(V1)重组质粒过表达Beas-2B细胞系中的ALK蛋白,同时设置阴性对照;应用Western Blot、RT-PCR检测转染及加药后PD-L1的表达情况,同时应用Western Blot检测JAK3、STAT3、AKT、ERK1/2等的表达情况,探讨EML4-ALK调控PD-L1表达的潜在分子机制。结果:1.应用免疫组化的方法检测141例肺腺癌组织中PD-L1的表达情况,PD-L1阳性率按照50%cut-off值,5%cut-off值,1%cut-off值分别为22.0%(31/141),42.6%(60/141),58.9%(83/141)。PD-L1阳性多见于肿瘤大于等于3.0cm(52.1%vs 32.4%,P=0.018,5%cut-off值;67.1%vs 50.0%,P=0.039,1%cut-off值)、病理类型为浸润性腺癌(45.3%vs 18.2%,P=0.038,5%cut-off值)及ALK重排(38.1%vs 15.2%,P=0.003,50%cut-off值;69.0%vs 31.3%,P0.001,5%cut-off值;73.8%vs 52.5%,P=0.019,1%cut-off值)的患者。以50%cut-off值判定PD-L1阳性的标准进行Kaplan-Meier生存分析显示:PD-L1阳性患者的无病生存期(disease-free survival,DFS)和总生存期(overall survival,OS)明显短于PD-L1阴性患者(log-rank?~2=7.087,P=0.008,DFS;log-rank?~2=4.705,P=0.030,OS)。单因素分析显示:影响DFS的因素包括病理分期(HR,5.31;95%CI 2.81-10.03;P0.001)、PD-L1过表达(HR,2.07;95%CI 1.16-3.70;P=0.014);影响OS的因素包括病理分期(HR,9.99;95%CI 3.36-29.70;P0.001)、病理亚型(HR,3.76;95%CI 1.39-10.14;P=0.009)、辅助治疗(HR,0.18;95%CI 0.07-0.49;P0.001)和PD-L1过表达(HR,2.63;95%CI 1.05-6.60;P=0.039)。Cox多因素分析显示:独立影响DFS的因素包括病理分期(HR,3.95;95%CI 2.26-6.93;P0.001)、PD-L1过表达(HR,1.95;95%CI 1.14-3.33;P=0.015);独立影响OS的因素包括病理分期(HR,8.15;95%CI 3.01-22.07;P0.001)、病理亚型(HR,3.75;95%CI 1.44-9.79;P=0.007)、辅助治疗(HR,0.23;95%CI 0.09-0.57;P=0.002)。PD-L1过表达是影响患者DFS的独立预后因素,PD-L1阳性患者DFS更短;PD-L1过表达是患者OS的预后不良因素,但PD-L1过表达并非非小细胞肺癌患者OS的独立预后因素。2.Western Blot结果显示:PD-L1蛋白在ALK阳性肺腺癌细胞系H2228、H3122中的表达要高于ALK阴性细胞系A549、GLC-82及正常肺支气管上皮细胞系Beas-2B;RT-PCR结果显示:PD-L1mRNA在ALK阳性细胞系的表达同样显著高于阴性及正常细胞系;细胞免疫荧光显示:PD-L1蛋白主要表达在细胞膜上,且H3122细胞PD-L1荧光强度显著高于A549细胞。3.Western Blot、RT-PCR结果显示:ALK抑制剂TAE684、ALK siRNA-1及ALK siRNA-2成功使H3122细胞中的ALK蛋白低表达,同时也下调了PD-L1蛋白的表达;转染了EML4-ALK(V1)重组质粒的Beas-2B细胞成功表达了ALK蛋白,同时也上调了PD-L1的表达;应用ALK抑制剂TAE684处理H3122细胞时,JAK-STAT3通路、PI3K-AKT通路及EKR1/2通路蛋白的活性受到抑制;而当Beas-2B细胞过表达外源性EML4-ALK基因后,JAK-STAT3通路、PI3K-AKT通路及EKR1/2通路蛋白表达升高,说明上述通路可能参与ALK对非小细胞肺癌PD-L1表达的调控。结论:PD-L1在ALK阳性非小细胞肺癌患者组织和ALK阳性非小细胞肺癌细胞系中高表达,同时PD-L1高表达可作为肺腺癌患者预后不良的标记物。抑制ALK蛋白表达可下调PD-L1的表达;过表达外源性EML4-ALK基因可上调PD-L1的表达。JAK-STAT3通路、PI3K-AKT通路及EKR1/2通路可能参与ALK对非小细胞肺癌PD-L1表达的调控。上述发现为肺癌的分子靶向治疗联合免疫治疗提供了理论依据。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

非小细胞肺癌,情况,阴性,临床病理特征

8-L1 在非小细胞肺癌组织中的染色情况。注：A：50% cut-off 值% cut-off 值阳性染色；C：1% cut-off 值阳性染色；D：阴性染同 cut-off 值下 PD-L1 在 ALK 阳性及 ALK 阴性 NSCLC 患者中的注：A：50% cut-off 值；B：5% cut-off 值；C：1% cut-off 值究分析PD-L1过表达和非小细胞肺癌其它临床病理特征之间的关阳性多见于肿瘤大于等于 3.0cm（52.1% vs 32.4%，P = 0.018，5%

阳性率,阴性,患者,临床病理特征

8图 2：不同 cut-off 值下 PD-L1 在 ALK 阳性及 ALK 阴性 NSCLC 患者中的阳性率对比。注：A：50% cut-off 值；B：5% cut-off 值；C：1% cut-off 值本研究分析PD-L1过表达和非小细胞肺癌其它临床病理特征之间的关系（表1）。PD-L1 阳性多见于肿瘤大于等于 3.0cm（52.1% vs 32.4%，P = 0.018，5% cut-off

【参考文献】