Gankyrin在膀胱癌侵袭进展中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-19 17:19

【摘要】：【背景】在我国,膀胱癌(Bladder cancer,BC)发病率居泌尿系统恶性肿瘤之首。依据生长方式的不同,膀胱癌可以分为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),前者占初诊膀胱癌患者的70%左右,主要采用经尿道膀胱恶性肿瘤电切术(TURBT),5年生存率达90%,NMIBC患者术后易复发进展,约15%术后会进展为MIBC,患者预后变差;后者占30%左右,主要采用根治性膀胱切除术,术后约50%发生转移,发生转移后5年生产率仅为5%。膀胱癌侵袭进展对人类健康造成很大的威胁,明确膀胱癌侵袭进展的机制,对改进膀胱癌现有治疗和预后判断具有重要作用。癌蛋白Gankyrin在众多恶性肿瘤的形成中发挥促癌作用。Gankyrin最初在肝癌研究中被发现,近来研究表明Gankyrin在结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肺癌和食道癌等多种恶性肿瘤发挥促癌作用,且与肿瘤恶性程度有关。目前,Gankyrin在膀胱癌发生、发展中的具体作用和分子机制尚未明确。我们前期对10例膀胱癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织进行转录组测序,结果显示Gankyrin在膀胱癌组织中表达高于癌旁正常组织,根据膀胱癌经典分子起源学说及最新膀胱癌组织高通量测序结果,P53信号通路与膀胱癌侵袭性高度相关,而根据文献检索,Gankyrin为P53分子的上游调控分子,因此我们推测Gankyrin在膀胱癌的侵袭进展过程中发挥重要作用。【目的】研究Gankyrin在膀胱癌中的表达情况,探讨其在膀胱癌侵袭进展中的作用及机制,以期为膀胱癌靶向治疗和预后判断提供新依据。【材料和方法】1.对10对膀胱癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织进行转录组测序,根据膀胱癌发生分子机制假说及文献报道,筛选出Gankyrin作为研究对象。2.提取90对膀胱癌组织及癌旁正常组织的RNA及20对膀胱癌组织及癌旁正常组织的总蛋白,分别通过qRT-PCR和western blot验证Gankyrin在膀胱癌中的表达情况。3.通过公共数据库Oncomine挖掘数据,验证Gankyrin在膀胱癌患者的肿瘤组织中存在高表达。4.通过免疫组化,对3例肌层浸润性膀胱癌病理大切片行Gankyrin染色,分析肿瘤侵犯粘膜层、浅肌层、深肌层时的表达情况,研究其和膀胱癌侵袭性的关系;分析130例膀胱癌患者肿瘤组织中Gankyrin的表达量,探讨其与膀胱癌临床病理资料和预后的关系。5.通过western blot和qRT-PCR检测Gankyrin在正常尿路上皮、2种非肌层浸润性膀胱癌、2种肌层浸润性膀胱癌细胞系中的表达量。6.利用慢病毒载体构建Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞系和Gankyrin稳定敲减的UMUC3细胞系,通过EdU细胞增殖试验和NOD/SCID小鼠的皮下成瘤实验,研究Gankyrin过表达和敲低对膀胱癌细胞增殖、成瘤能力的影响。通过细胞划痕实验和Transwell小室迁移侵袭实验,检测Gankyrin对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响。通过流式细胞术检测Gankyrin对膀胱癌细胞凋亡的影响。7.利用BBN诱导小鼠自发产生膀胱癌,通过免疫组化检测Gankyrin在小鼠自发膀胱癌模型中的表达情况并探讨其意义。8.通过连续切片免疫组化染色,分析32例膀胱癌组织中Gankyrin和MDM2表达的相关性,利用western blot检测Gankyrin过表达和敲低后MDM2的表达水平,通过免疫荧光检测Gankyrin和MDM2在膀胱癌中的亚细胞定位,利用蛋白免疫共沉淀检测Gankyrin与MDM2在膀胱癌中的相互作用,以探讨Gankyrin调控膀胱癌侵袭进展的可能机制。【结果】1.转录组测序结果表明Gankyrin表达量在9例膀胱癌组织中高于对应癌旁正常尿路上皮组织,对10对癌及癌旁组织RPKM值进行统计分析,Gankyrin在膀胱癌组织中表达显著上调(P0.05),差异表达倍数为1.21倍。2.通过qRT-PCR检测90例膀胱癌患者中Gankyrin mRNA的表达情况,发现其中66例患者肿瘤组织中Gankyrin mRNA表达量高于癌旁正常组织,24例患者中肿瘤组织Gankyrin表达量低于癌旁组织,Gankyrin高表达比例为73.3%。对20对膀胱癌组织及癌旁正常组织进行western blot检测,发现其中17例样本的肿瘤组织中Gankyrin蛋白的表达量明显高于癌旁正常组织。3.公共数据库Oncomine检索发现Dyrskjot Bladder 3数据集中,Gankyrin mRNA在膀胱癌患者肿瘤组织中的表达含量高于正常尿路上皮组织(P0.01)。4.在3例膀胱癌病理大切片中,Gankyrin表达量从粘膜、浅肌层到深肌层逐渐升高;130例免疫组化的结果显示,Gankyrin表达量在肌层浸润性膀胱癌中显著高于非肌层浸润性膀胱癌(P0.01)、在高级别膀胱癌组织中显著高于低级别组织(P0.01),Gankyrin高表达患者总体生存期、疾病特异性生存期和无进展生存期显著低于低表达患者(均P0.001),多因素分析显示,Gankyrin为膀胱癌不良预后的独立危险因素。5.western blot和qRT-PCR结果显示,Gankyrin在膀胱癌细胞系中的表达量高于正常尿路上皮细胞系,Gankyrin在NMIBC细胞系BIU87和SW780中表达量低,而在MIBC细胞系UMUC3和J82中存在高表达。6.成功构建Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞株和Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞株,EdU细胞增殖实验表明Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞增殖能力显著强于对照组(P0.01),而Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞的增殖能力显著降低(P0.001);Gankyrin稳定过表达后的BIU87细胞小鼠皮下肿瘤增殖能力明显强于对照组(P0.001),而Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞小鼠皮下肿瘤增殖能力显著弱于对照组(P0.001);划痕实验和Transwell小室迁移实验显示,Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞迁移能力显著增强,Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞迁移能力显著下降;Transwell小室侵袭实验显示,Gankyrin过表达可显著增强膀胱癌细胞的侵袭能力,而Gankyrin敲低可显著抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。流式细胞术检测结果显示Gankyring过表达或敲低并不影响BIU87或UMUC3细胞的凋亡。7.成功利用BBN诱导小鼠自发形成膀胱癌,免疫组化结果显示,Gankyrin在膀胱癌中的表达量高于正常尿路上皮组织,在NMIBC、MIBC及肺转移组织中表达量逐渐升高。8.32例膀胱癌连续切片免疫组化显示,Gankyrin和MDM2呈正相关(R=0.583,P0.001)。上调BIU87细胞Gankyrin表达量,MDM2表达相应上调,下调UMUC3细胞Gankyrin表达量,MDM2表达相应下调,免疫荧光显示Gankyrin和MDM2在BIU87细胞及膀胱癌组织中存在共定位,蛋白免疫共沉淀显示Gankyrin和MDM2在BIU87细胞中相互结合。【结论】癌蛋白Gankyrin在膀胱癌组织中显著上调,Gankyrin的表达水平升高与膀胱癌的分期分级升高密切相关,且是膀胱癌不良预后的独立危险因素。上调Gankyrin的表达可以增强膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,下调Gankyrin的表达显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Gankyrin在膀胱癌中与MDM2直接结合,为调控膀胱癌侵袭进展的潜在分子机制。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14
【图文】：

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图 1. 膀胱癌侵袭进展的分子机制26S 蛋白酶体非 ATP 酶亚基 10（26S proteasome non-ATPase regulatory subunD10），又称 p28GANK、p28、Gankyrin，位于人类的 X 染色体 22 区 3 带上，蛋白 Gankyrin 由 226 个氨基酸残基所组成，并且有 2 个典型的结构域：7 个锚序列和视网膜母细胞瘤识别序列，其表达在众多恶性肿瘤中有着重要临床意yrin 最初在肝癌研究中被发现，随着研究的深入，陆续发现在结肠癌、胰腺、肺癌和食道癌等恶性肿瘤也存在高表达[15][18-22]。前期研究发现，Gankyrin 通4 相互作用来调控抑癌蛋白 Rb 的磷酸化，并且通过结合 E3 泛素连接酶 Mdm p53 的泛素化，最终促进 Rb 和 p53 的降解，有助于恶性肿瘤的形成[23-27]。也明 Gankyrin 可与 RelA 相互作用，通过 SIRT1 的乙酰化来抑制 NF-Κb 的活性有研究表明 Gankyrin 可结合 HNF4α，促进其降解并决定肿瘤的分化程度，也合 KEAP1 来抑制 Nrf2 的降解，在肿瘤的氧化应激和线粒体损伤中起作用[30,根据膀胱癌经典分子机制学说，肌层浸润性膀胱癌和非肌层浸润性膀胱癌来源子通路改变[4]，其中，肌层浸润性膀胱癌的特征性分子通路改变之一为 P53 信

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图 2. Gankyrin 在 10 对膀胱癌及癌旁组织中的转录组测序结果A. Gankyrin 在 10 对膀胱癌及癌旁组织中的 RPKM 值B. Gankyrin 在 10 对膀胱癌及癌旁组织中 PRKM 值的统计分析注：*p 值＜0.052、在膀胱癌及癌旁组织中验证 Gankyrin 的高表达如图2A所示，在20例膀胱癌患者肿瘤及癌旁组织样本中，western blot显示Ganky蛋白在 17 例样本的肿瘤组织中的表达量高于癌旁组织，经统计分析，膀胱癌组织Gankyrin 蛋白表达量显著高于癌旁组织（图 3B，P＜0.01）。实时定量 PCR 结果显示Gankyrin mRNA 表达量在 66 例患者的肿瘤组织中高于癌旁组织，在 24 例患者肿瘤组中低于癌旁组织，高表达比例为 73.3%。

【参考文献】