MicroRNA-183-5p靶向Erbin调控急性髓系白血病增殖与分化的机制研究

发布时间：2020-06-20 02:57

【摘要】：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种常见的血液系统恶性肿瘤。成人总体发病率75.3/10万人,死亡率53.4/10万人,发病率和死亡率在成人所有恶性肿瘤中位居第13位及第9位。目前AML治疗进展缓慢,尽管对AML的生物学特征的理解日渐深入,新的靶向治疗药物被研发使用,但总体生存率仍低。具有自我更新能力的白血病干细胞是白血病细胞恶性增殖的“罪魁祸首”,而这些细胞具有高增殖、低凋亡、分化阻滞、耐药等特性,导致白血病病人在化疗放疗得到完全缓解后复发率仍非常高。AML发病机制复杂,异质性极高,绝大部分类型治疗效果差,预期生存期短。分子生物学特征是判断AML预后的重要标志之一。超过95%的AML病人至少携带1种体细胞突变。目前临床常用预后相关基因仍然存在较大局限性。因此发现新的预后因素,探索其功能,阐明在AML环境中的作用机制,在AML诊断及治疗中具有重要意义。络氨酸激酶受体ErbB2(v-erb-b2 avian erythroblast leukemia viral oncogene homolog 2)基因,也被称为HER2(human epidermal growth factor receptor 2)作为一种癌基因已被广泛研究和认知。它通过激活经典络氨酸激酶下游分子如RAS、MAPK,诱导肿瘤细胞有丝分裂增强,并由此导致多种肿瘤预后不良。2000年,Borg通过酵母双杂交法发现了一个新的PDZ(PSD95/discs large/ZO-1)蛋白,它在上皮细胞中作为ErbB2的交互作用蛋白发挥作用,故将其命名为Erbin(ErbB2 interacting protein,也称为Erbin)。Erbin属于一种全新的PDZ蛋白家族,称为LAP(leucine-rich repeat and PDZ domain)家族。Erbin的功能目前尚不十分清楚,其在大多数人组织中表达,在脑、心脏、肾脏、肌肉及胃组织中较为丰富,对维持细胞结构完整、调节细胞增殖和分化、发育过程中器官形态的发生及信号转导途径等具有重要作用。Erbin在实体肿瘤的发生发展中的功能尚存在争议,在急性髓系白血病中的功能及机制尚不明确。miRNAs是一种广泛存在的对基因进行微调的分子,约占人类基因组总基因数的2%-3%。从结构上来说,miRNAs是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA,约22nt,通过5’端6-8个序列(种子序列)与其靶基因的m RNA分子的3’端非编码区域(3’UTR)互补配对在转录后水平上对基因的表达进行负调控,一个miRNA可以调控多个靶基因。miRNA可导致m RNA的降解或翻译抑制,从而进一步调控多种生物学行为如发育的进程、干细胞分化、细胞凋亡、疾病以及肿瘤发生等。既往研究表明,miR-183在肿瘤中通常呈高表达。miR-183在肿瘤细胞中高表达常伴随等位基因失衡,染色体断裂、复制数增加等,常表现为致癌作用。迄今为止,有关miR-183与Erbin在AML中的研究较少。本研究通过体外、体内实验及临床验证揭示了Erbin与AML发生、发展的关系,Erbin在AML可抑制细胞增殖,促进幼稚细胞分化成熟,起抑癌作用。并通过生物信息学预测,体外实验验证miR-183-5p对Erbin在AML中的调控,通过免疫荧光素酶报告基因及功能挽救实验证实miR-183-5p对Erbin的直接靶向作用,表明miR-183-5p通过靶向Erbin调控AML的增殖、分化能力,miR-183-5p/Erbin通路是AML潜在的治疗靶点。第一部分体外研究Erbin对AML细胞增殖、分化作用及信号通路的影响研究目的:通过体外实验探索及分析Erbin对AML增殖及分化功能的影响及相关机制。研究方法:通过定量PCR和Western Blot检测4种AML细胞株HL60、THP-1、SHI-1和U937中内源性Erbin表达,并挑选出相对表达高及低的细胞各1株。转染Erbin过表达质粒慢病毒使其在低表达细胞株中过表达,转染sh RNA慢病毒使Erbin在高表达细胞株中下调。用过CCK8及流式细胞术检测上述两种细胞和各自空载体对照组细胞周期、增殖、凋亡及分化情况,以及与细胞周期调节蛋白p21Waf1/CIP1、p27Kip1表达的关系。结果:U937中Erbin相对表达量较高,HL60和SHI-1细胞中表达量较低,HL-60与SHI-1表达量无显著性差异。过表达Erbin的HL60细胞48h细胞活性较对照组显著降低,G2/M期细胞比例较对照组降低,凋亡率较对照组增高,细胞周期调节蛋白p21Waf1/CIP1、p27Kip1表达升高,分化程度较对照组升高。下调Erbin的U937细胞48h细胞活性较对照组显著增高,G2/M期细胞比例较对照组升高,p21Waf1/CIP1、p27Kip1表达减低,分化程度较对照组降。差异具有统计学意义。结论:体外Erbin在AML细胞中通过抑制细胞增殖、细胞周期,促进细胞凋亡及细胞分化来发挥抗肿瘤活性。第二部分体内研究Erbin对AML增殖及分化的影响研究目的:体内实验验证Erbin对AML增殖及分化功能的影响。研究方法:构建裸鼠AML荷瘤及对照模型,对模型鉴定分析Erbin在体内的作用。肿瘤组织行免疫组化,外周血镜检髓系白血病细胞浸润程度,肝脏及脾脏行病理学活检,流式细胞术检测骨髓细胞CD33表达阳性率。结果:Erbin过表达HL-60组荷瘤小鼠较其对照组小鼠肿瘤体积小,免疫组化显示p RAF、p ERK1/2、CD11b较对照组高表达,外周血涂片显示髓系白血病细胞浸润较对照组降低,骨髓细胞CD33阳性率较对照组降低,肝脏、脾脏HE染色光镜下原始细胞比例无显著差异;Erbin下调U937组荷瘤小鼠其对照组小鼠肿瘤体积大,免疫组化显示p RAF、p ERK1/2、CD11b较对照组低表达,外周血涂片显示髓系白血病细胞浸润较对照组增加,骨髓细胞CD33表达较对照组升高,肝脏、脾脏HE染色光镜下原始细胞比例无显著差异。结论:Erbin在体内可抑制AML细胞增殖、促进细胞凋亡及细胞分化,与体外实验的结果相符。第三部分hsa-miR-183-5p直接靶向作用Erbin调控AML细胞的增殖研究目的:探讨miR-183-5p对Erbin的调控机制以及对AML细胞生物学行为的影响。研究方法:通过生物信息学预测,定量PCR在AML细胞株HL60及937中筛选可能调控Erbin的miR。定量PCR及Western blot验证目标miR对Erbin的调控。CCK8及流式细胞术检测目标miR在HL60及937细胞中影响细胞周期、增殖、凋亡的情况,荧光素酶报告基因及功能挽救实验验证miR-183-5p与Erbin的直接结合作用。临床样本检测miR-183-5p/Erbin的表达水平。结果:经筛选miR-183-5p被认为可能参与调控Erbin。经PCR及Western blot验证,miR-183-5p可在m RNA及蛋白水平调控Erbin的表达。miR-183-5p通过调控Erbin的表达调节RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT/Fox O3a通路的磷酸化水平,经CCK8及流式细胞术检测,miR-183-5p可调控HL-60/U937细胞的增殖、凋亡和细胞周期。免疫荧光素酶报告基因及功能挽救实验证实miR-183-5p与Erbin存在直接结合与调控。Erbin在AML患者体内水平明显低于健康对照组,pri-miR-183-5p及mature-miR-183-5p在AML患者体内水平显著高于正常对照组。差异具有统计学意义。结论:miR-183-5p通过与Erbin直接结合调控AML的增殖
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.71

【参考文献】