MiR-155靶向抑制TGFβ R2表达促进胃癌生长侵袭的实验研究

发布时间：2020-06-22 10:37

【摘要】：研究背景:胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,因发病隐匿且预后较差,具有较高的病死率,而我国更是胃癌大国,每年新发胃癌病例约占全球的40%。随着对胃癌发病的分子信号通路的深入研究,寻找胃癌新的分子靶点受到了广泛关注。转化生长因子βII型受体(transforming growth factor beta type II receptor,TGFβR2)通过将细胞外信号转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)传至细胞内而引起多种生物反应,包括细胞增殖、分化、运动、凋亡及免疫反应,TGFβR2的失活可引起TGF-β信号通路传导障碍,导致肿瘤细胞的生长、浸润和转移。微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)是一类高度保守、非编码的单链小分子RNA,通过与靶mRNA的3’端非翻译区(3’untanslated region,3’UTR)结合,阻遏信使RNA(messenger RNA,mRNA)的翻译,通常在转录后水平高效调控基因表达,密切参与了肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等病理过程。本课题在前期研究中发现miR-155在胃癌患者血清中拷贝数明显高于正常健康人群;且在胃癌组织中发现TGFβR2蛋白水平降低,而TGFβR2 mRNA水平在胃癌组织和癌旁正常胃组织中水平无显著差异,推测TGFβR2在转录后水平发生调控;进一步检测miR-155水平发现其在胃癌组织中显著增高。研究目的:本研究旨在探索在胃癌发病过程中TGFβR2表达异常的潜在调控机制,筛选出影响TGFβR2表达的上游miRNA,并探索miRNA-TGFβR2信号通路对胃癌增殖、侵袭、凋亡等生物学行为的影响,进而通过该传导通路明确新的分子靶点,为胃癌的靶向治疗提供新的依据和思路。研究方法:组织实验:胃癌组织及癌旁正常组织中TGFβR2的表达情况、TGFβR2mRNA水平及miR-155水平分析。收集来自天津医科大学肿瘤医院经手术切除患者的胃腺癌组织及其配对的癌旁正常胃组织,分别应用Western blot、qRT-PCR方法检测TGFβR2蛋白及其mRNA表达水平;采用qRT-PCR中的Taqman探针法检测组织中miR-155的表达水平。靶点预测:分别使用生物信息学软件miRanda、TargetScan、PicTar,寻找潜在作用于TGFβR2 mRNA的上游miRNA。体外实验:明确miR-155-TGFβR2信号通路对胃癌细胞系SGC7901生物学行为的影响。应用荧光素酶报告(Luciferase)实验验证miR-155能否能直接调控TGFβR2的表达。分别向SGC7901和MGC803细胞中转染miR-155 mimics和miR-155inhibitor,并于48小时后提取蛋白、RNA,检测miR-155表达水平、TGFβR2蛋白表达和TGFβR2 mRNA水平,验证miR-155对TGFβR2的调控作用。转染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor上调和下调胃癌细胞系miR-155水平后,通过细胞功能实验(细胞划痕实验、Transwell、细胞增殖实验)验证miR-155对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响。转染TGFβR2 siRNA和TGFβR2过表达质粒下调或上调胃癌细胞系中TGFβR2的表达水平,通过细胞功能实验(细胞划痕实验、Transwell、细胞增殖实验)验证TGFβR2对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响。体内实验:验证miR-155-TGFβR2信号通路在体内对肿瘤生长的影响。将未经干预的对照组SGC7901、过表达miR-155的SGC7901和转染TGFβR2过表达质粒的SGC7901植入裸鼠皮下,4周后处死,剥离肿瘤。拍照肿瘤并测量大小、重量,通过Western blot、qRT-PCR方法检测检测瘤组织中TGFβR2的表达情况、TGFβR2 mRNA水平及miR-155水平。同时瘤组织进行HE染色和免疫组化实验进行分析。研究结果:组织实验:TGFβR2在胃腺癌组织中表达水平显著高于癌旁正常胃组织,而TGFβR2 mRNA水平在两种组织中无显著差异;胃癌组织中miR-155的表达水平较癌旁组织显著增高。靶点预测:生物信息学软件预测TGFβR2可能为miR-155的潜在靶点,miR-155与TGFβR2的3’-UTR区反向互补特异性结合,并在多物种间高度保守。体外实验:miR-155通过靶向抑制TGFβR2表达促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移。荧光素酶报告实验结果显示:当把野生型的TGFβR2 mRNA的3’UTR区的报告基因质粒与miR-155 mimics共转染到胃癌细胞中,荧光活性下降;当把野生型报告基因质粒与miR-155 inhibitor共转染至胃癌细胞中,荧光活性增强;当把突变型TGFβR2 mRNA的3’UTR区的报告基因质粒分别与miR-155 mimics和miR-155 inhibitor共转染至胃癌细胞中,荧光素酶活性未受到影响。证实了miR-155通过靶向结合TGFβR2 mRNA的3’UTR区对TGFβR2靶向调控。通过在胃癌细胞中转染miR-155 mimics使miR-155过表达、转染miR-155inhibitors使miR-155表达受抑制。Western Blot结果示过表达miR-155时,TGFβR2蛋白表达水平降低;抑制miR-155表达时,TGFβR2蛋白表达水平增高。而无论过表达还是抑制miR-155,TGFβR2 mRNA水平均无明显改变。细胞功能实验证实分别将miR-155 mimics、miR-155 inhibitors转染至胃癌细胞系SGC7901中后,过表达miR-155促进了胃癌细胞增殖、侵袭、转移,而抑制miR-155表达后则抑制了胃癌细胞增殖、侵袭、迁移。转染TGFβR2 siRNA促进了胃癌细胞增殖、侵袭和迁移;过表达TGFβR2质粒则抑制了胃癌细胞增殖、侵袭、迁移。体内实验:过表达miR-155组的肿瘤体积、质量较对照组、TGFβR2过表达组显著增大,miR-155水平升高,TGFβR2蛋白表达降低,TGFβR2 mRNA水平较对照组无明显变化;TGFβR2过表达组肿瘤体积、质量较对照组、过表达miR-155组显著减小,miR-155水平受到抑制,TGFβR2蛋白表达增强,TGFβR2mRNA水平增高。研究结论:miR-155通过靶向抑制TGFβR2的表达促进胃癌的生长、侵袭。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

肿瘤组织,血清,细胞系,慢病毒

图 1.1 胃癌患者及正常人群血清中 miR-155 的表达量（A）；胃癌患者肿瘤组织及癌旁正常组织中 miR-155 的表达量（B）。（**代表 P＜0.01）1.2.2 体外实验证实 miR-155 对胃癌生物学行为的影响1.2.2.1 构建稳定过表达/沉默 miR-155 的 SGC7901 细胞系首先构建在 SGC7901 中稳定过表达 miR-155 的细胞系及其相对照的慢病毒空载质粒转染 SGC7901 细胞系；构建在 SGC7901 中 miR-155 表达沉默的细胞系及其相对照的慢病毒空载质粒转染 SGC7901 细胞系。即分别将 miR-155 mimics（miR-155 类似物）、NC mimics、miR-155 inhibitors（miR-155 抑制物）、NCinhibitors 分别转染至 SGC7901 细胞系中。转染成功后利用 qRT-PCR 技术对转染后的SGC7901细胞中的miR-155水平进行定量分析。如图1.2所示，转染miR-155mimics 组中，胃癌细胞内 miR-155 水平明显升高，明显高于两个慢病毒空载质粒转染组和 miR-155 inhibitors 组；转染 miR-155 inhibitors 组中，胃癌细胞内miR-155 水平在 4 组中最低。因此，分别通过转染 miR-155 mimics 或 inhibitors可上调或下调胃癌细胞系中 miR-155 表达水平。

胃癌细胞,转染,表达水平

（miR-155 类似物）、NC mimics、miR-155 inhibitors（miR-155 抑制物）、NCinhibitors 分别转染至 SGC7901 细胞系中。转染成功后利用 qRT-PCR 技术对转染后的SGC7901细胞中的miR-155水平进行定量分析。如图1.2所示，转染miR-155mimics 组中，胃癌细胞内 miR-155 水平明显升高，明显高于两个慢病毒空载质粒转染组和 miR-155 inhibitors 组；转染 miR-155 inhibitors 组中，胃癌细胞内miR-155 水平在 4 组中最低。因此，分别通过转染 miR-155 mimics 或 inhibitors可上调或下调胃癌细胞系中 miR-155 表达水平。图 1.2 转染 miR-155 mimics 和 miR-155 inhibitors 后胃癌细胞中 miR-155 的表达水平。（***代表 P＜0.001）A B

【参考文献】