MLLT3在肺腺癌中的生物学功能及分子机制研究

发布时间：2020-06-22 12:50

【摘要】：目的肺癌是全世界发病率和死亡率最高的癌症。MLLT3,也被称为AF9,最初在急性髓系白血病中作为混合谱系白血病基因MLL的融合伙伴,由染色体异位形成的MLL-AF9融合基因是急性髓系白血病患者11q23易位中最常见的一种,目前MLLT3的功能尚未完全明确,本课题的研究目的是探索MLLT3在肺腺癌中的潜在生物学功能及分子机制。方法(1)应用免疫组化法检测MLLT3在74对肺腺癌组织及癌旁组织中的表达差异,通过免疫组化染色的评分情况分析MLLT3在组织中的表达强度,将74例组织标本划分为高表达组及低表达组,进一步分析MLLT3的表达情况与临床参数的关系;通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法(Western Blot)检测MLLT3在人肺腺癌细胞株PC9、A549、H1299和H1975及人正常支气管上皮细胞细胞BEAS-2B中的表达差异,筛选出MLLT3高表达细胞株A549和NCI-H1299。(2)根据MLLT3的基因序列设计小干扰RNA(siRNA)转染A549和NCI-H1299细胞,MLLT3在肺腺癌细胞中的功能通过CCK8实验、克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验以及流式细胞术等方法检测;在机制研究中,采用Western blot技术检测MLLT3调控相关信号通路、细胞周期、凋亡及EMT相关分子标记在蛋白水平的变化。(3)构建包含短发夹RNA(shRNA)的慢病毒转染A549细胞沉默MLLT3基因的表达,采用裸鼠皮下瘤实验进行MLLT3基因敲减后体内实验的研究。结果(1)免疫组化检测结果表明MLLT3在肺腺癌组织中的表达强度高于癌旁组织,MLLT3的表达和有无远处转移及肺癌的TNM分期有关,生存分析显示MLLT3高表达与肺腺癌患者总体生存期呈负相关。(2)MLLT3在A549和NCI-H1299细胞中高表达,通过siRNA敲减MLLT3可显著抑制A549和NCI-H1299细胞的增殖能力及平板克隆形成能力,也可显著抑制A549和NCI-H1299细胞的迁徙和侵袭能力,采用流式细胞技术分析细胞周期分布及细胞凋亡情况,结果显示敲减MLLT3后A549和NCI-H1299细胞G0/G1期细胞和凋亡细胞比例较对照组显著增多,S期细胞比例较对照组减少;进一步的机制研究中,EGFR-MAPK/ERK通路相关蛋白p-EGFR、p-ERK、p-MEK、cmyc及EMT相关分子标记,包括间质细胞标记物Vimentin、N-cadherin的表达水平下调,上皮细胞标记物E-cadherin和p21的表达水平上调;凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP的表达水平上调,周期相关蛋白CDK4、CyclinD表达下调。(3)裸鼠皮下瘤实验中,转染包含靶向MLLT3短发夹RNA(shRNA)慢病毒组的裸鼠皮下瘤生长速率较包含无义序列短发夹RNA慢病毒组减慢,皮下瘤重量较对照组组显著减轻。结论(1)MLLT3在肺腺癌组织显著高表达,与肺腺癌患者的临床病理因素以及总体生存期相关。(2)MLLT3在肺腺癌进展中起促癌作用,有可能成为一个潜在的预后判断因素和治疗的靶点。(3)EGFR-MAPK/ERK通路参与MLLT3对肺腺癌作用的过程。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

肺腺癌,患者,表达水平,肿瘤

17图 1-1 MLLT3 在配对的人肺腺癌及其癌旁组织中的表达情况Figure1-1: Relative MLLT3 expression in LUAD tissues and their corressponding non-tumtissues. * p < 0.05， ** p < 0.013.2 MLLT3 在肺腺癌患者癌组织中的表达水平与肺腺癌患者的不良预后有关为进一步探究 MLLT3 是否影响肺腺癌患者的不良预后，如表 1-4 所示，我们分析了 MLLT3 的表达水平与肺腺癌临床病理特征的相关性。我们共有 74 例腺癌患者的组织标本，我们将 74 例肺腺癌患者根据病理切片的免疫组化染色分情况分为 MLLT3 高表达组(45/72)和 MLLT3 低表达组(29/72)，卡方检验结果明 MLLT3 蛋白表达水平与肺腺癌患者的肿瘤有无远处转移(p= 0.019)和肿瘤TNM 分期(p = 0.005)相关，但是与患者的年龄、性别、肿瘤大小、是否合并淋结转移无相关性(p＞0.05)，此外，如图 1-3 所示，我们结合肺腺癌患者的生存随访数据，采用 Kaplan-Meier 生存分析法分析了 MLLT3 表达水平与肺腺癌患

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：MLLT3 的表达水平与肺腺癌患者总体生存期的相关性分析e1-3: Kaplan-Meier analyses of overall survival according to MLLT3 expressry in LUAD patientsLLT3 蛋白在肺腺癌 A549 和 NCI-H1299 中高表达前面免疫组化结果表明 MLLT3 蛋白表达水平在肺腺癌患者癌组临近癌旁组织，且 MLLT3 在肺癌组织中的表达水平和患者的预结果提示 MLLT3 可能在肺腺癌的进展中起到促进肿瘤发生发展步验证 MLLT3 在肺腺癌中的生物学功能和机制，我们分别从 m水平验证 MLLT3 在 4 种肺腺癌细胞（PC9、A549、H1299 和 H正常支气管上皮细胞（BEAS-2B）中的表达（图 1-4），结果表明胞中 MLLT3 均呈显著高表达，在 A549 细胞中表达最高，表达量 PC9 及人正常支气管上皮细胞 BEAS-2B。因此我们选择 MLLT的肺腺癌细胞 A549 和 NCI-H1299 进行接下来的实验，MLLT3 肺腺癌细胞中的异常高表达状态可能与肺腺癌的恶性表型有密切

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