mPGES-1及其介导miRNAs信号通路在肝细胞癌恶性进展中的作用及机制的初步研究

发布时间：2020-06-22 23:03

【摘要】：研究目的构建mPGES-1-RNAi慢病毒(前列腺素E2合成酶-1-RNAi)并感染肝癌细胞,观察干扰mPGES-1基因对肝癌细胞SMMC7721和HepG_2体外增殖、迁移和侵袭能力的影响。采用miRNAs芯片方法检测肝癌细胞HepG_2 mPGES-1基因被干扰后miRNAs差异表达情况,并加以验证以及相关分析,以期发现mPGES-1介导miRNAs信号通路在肝细胞癌恶性进展中的作用及可能的分子机制。研究方法(1)构建mPGES-1-RNAi慢病毒并分别感染肝癌细胞SMMC7721和HepG_2,同时设置空载体组(NC组)和未感染组(Control组)。采用Western blot、PCR等方法检测干扰mPGES-1基因前后肝癌细胞SMMC7721和HepG_2中mPGES-1mRNA及蛋白的表达水平。运用CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测干扰mPGES-1基因对肝癌细胞SMMC7721和HepG_2增殖、迁移和侵袭能力的影响。(2)用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测干扰肝癌细胞株SMMC7721和HepG_2mPGES-1前后前列腺素E_2(PGE2)的含量。(3)采用miRNAs芯片筛选干扰肝癌细胞株HepG_2 mPGES-1基因后显著差异表达miRNAs,同时用qPCR加以验证,对差异表达最显著的miR-146a-5p用TargetScan、PITA、microRNAorg数据库进行靶基因预测。三个数据库取交集后的共同靶基因进行后续的GO和KEGG Pathway分析。(4)用免疫组织化学方法检测mPGES-1、cyclinD1和EGFR在肝癌组织和癌旁肝组织的表达情况,并分析它们之间的相关性。研究结果(1)成功构建mPGES-1-RNAi慢病毒并感染肝癌细胞SMMC7721和HepG_2,SMMC7721的病毒感染率约为80%,HepG_2的病毒感染率约为90%。(2)与未感染组(Control组)、空载体组(NC组)相比,肝癌细胞SMMC7721和HepG_2中mPGES-1基因干扰组(LV-2组)mPGES-1 mRNA和蛋白表达明显下调,且差异有统计学意义(P0.05)。(3)与未感染组(Control组)、空载体组(NC组)相比,肝癌细胞SMMC7721和HepG_2中mPGES-1基因干扰组(LV-2组)PGE_2含量明显下调,且差异有统计学意义(P0.05)。(4)CCK8实验及Transwell侵袭实验结果显示:在肝癌细胞SMMC7721和HepG_2中,mPGES-1基因干扰组(LV-2组)与未感染组(Control组)和空载体组(NC组)相比,细胞增殖、侵袭能力明显减弱,且差异有统计学意义(P0.05)。(5)细胞划痕实验结果显示:在肝癌细胞SMMC7721中,相对未感染组(Control组)与空载体组(NC组),mPGES-1基因干扰组(LV-2组)细胞迁移能力明显减弱,且差异有统计学意义(P0.05);在肝癌细胞株HepG_2中,相对未感染组(Control组)与空载体组(NC组),mPGES-1基因干扰组(LV-2组)细胞迁移能力有所下调,但差异统计无学意义(P0.05)。(6)miRNAs芯片筛选显著差异表达miRNAs与qPCR验证结果相对比:miR-146a-5p、miR-6889-5p、miR-3150b-3p、miR-4470表达上调;miR-20a-3p、miR-23a-5p、miR-629-5p、miR-7-1-3p、miR-6820-3p表达下调,以上结果与miRNA芯片结果相一致,其中上调miRNAs中miR-146a-5p改变最明显,上调倍数为4.12,下调miRNAs中miR-7-1-3p改变最明显,下调倍数为3.70。但miR-5191、miR-2276-3p、miR-892b表达上调,miR-521表达下调,这4个miRNAs的表达情况与芯片结果不一致。(7)差异表达最显著miR-146a-5p的靶基因预测及对靶基因的GO分析和KEGG分析结果显示:miR-146a-5p的候选靶基因有120个,有cyclinD1、EGFR等;且miR-146a-5p的靶基因主要调控基因转录、细胞转移、小GTPase介导的信号转导、脱磷酸作用、T细胞激活等生物学行为,主要富集在:肿瘤相关信号通路、Ras信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、ErbB信号通路等。(8)免疫组织化学染色结果显示:mPGES-1在肝癌组织中高表达率高于癌旁肝组织(77.78%vs.53.70%),差异有统计学意义(P0.05);cyclinD1在肝癌组织中高表达率高于癌旁肝组织(12.96%vs.1.85%),差异有统计学意义(P0.05);EGFR在癌旁肝组织中的高表达率高于肝癌组织(38.89%vs.72.22%),差异有统计学意义(P0.05)。对mPGES-1、cyclinD1、EGFR三者的相关性进行分析,结果显示:mPGES-1与cyclinD1呈正相关、与EGRF呈负相关,同时cyclinD1与EGFR呈负相关,且差异均具有统计学意义(P0.05)。研究结论(1)成功构建mPGES-1-RNAi慢病毒载体,高效感染肝癌细胞SMMC7721和HepG_2,可稳定、显著的降低mPGES-1基因的表达。(2)干扰mPGES-1基因可以减弱肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。(3)干扰肝癌细胞HepG_2 mPGES-1基因前后miRNAs的表达谱发生改变,mPGES-1可能通过miR-146a-5p靶向cyclin D1和EGFR影响肝细胞癌的恶性进展。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

人肝癌细胞,人肝癌细胞株,人肝癌,技术检测

结果的选择技术检测人肝癌细胞株 HepG2、SMMC7721、MHES-1 在 mRNA 水平上的表达水平，实验结果显示S-1 的表达量不同，SMMC7721 表达量最高，HepG2达量最低。根据实验设计选择高表达 mPGES-1 epG2进行后续实验。mPGES-1 mRNA 在各株人肝癌 1.2。

慢病毒感染,慢病毒,视野,明场

图 1.3 慢病毒感染 SMMC-7721 细胞的病毒感染率（NC：空载体组 LV-1：慢病毒干扰组 1 LV-2：慢病毒干扰组 2图 a,b,c 为明场视野；图 d,e,f 为荧光视野）Figure1.3 Virus infection rate of SMMC-7721 cells infected by lentivirus

【参考文献】