线粒体自噬功能异常在纳米氧化锌致人舌癌细胞CAL 27毒性中的作用

发布时间：2020-06-23 07:19

【摘要】：研究背景舌鳞状细胞癌是口腔癌中最常见的类型,具有高度局部侵袭和向远处转移的特点,是头颈部癌症患者死亡率居高不下的主要原因。传统的舌癌治疗多是以手术为主、化疗与放疗为辅的综合治疗,由于手术涉及范围大常导致患者咀嚼、吞咽及语音等功能受损,生活质量和预后极差。而放化疗药物,无法有效区分癌细胞和正常细胞,常给正常组织器官带来严重的副作用。因此,迫切需要开发一种具有新型作用的抗癌药物,在准确地杀死舌癌细胞同时,维持健康的口腔组织结构和功能。纳米生物技术被认为有潜力提供更有针对性的抗癌药物,显著提高癌症患者的预后。作为一种多功能的纳米金属氧化物,纳米氧化锌在口腔医学、化妆品等领域得到了广泛的应用。最近的研究中,纳米氧化锌被发现对一些肿瘤细胞具有毒性作用。那么纳米氧化锌是否会引起舌癌细胞的毒性?其毒性作用的机制又是什么?目前尚未有相关研究对其进行探讨。研究目的本项目以人舌鳞状细胞癌CAL27细胞系为体外研究对象,通过分析对比纳米氧化锌处理组与对照组细胞的增殖、抑制率异同、两组细胞内线粒体膜电位的高低异同、细胞内氧化还原指标ROS的水平变化、细胞内自噬相关蛋白以及选择性的线粒体自噬相关蛋白的表达水平变化,来分析和探索纳米氧化锌致癌细胞CAL 27毒性的最佳浓度和作用时间,以及明确在其毒性作用过程中,PINK1/Parkin蛋白信号轴介导的线粒体自噬所扮演的角色。材料与方法首先,采用透射电镜、动态光散射仪,比表面积测量仪等对实验中使用的市售纳米氧化锌颗粒的理化特征进行分析;其次,用含不同浓度的纳米氧化锌溶液培养CAL27细胞,通过细胞增殖能力实验得到纳米氧化锌致细胞毒性的50%抑制浓度;然后,采用上述浓度分别处理细胞0、4、8、12、24h后,采用细胞内活性氧荧光探针、线粒体膜电位检测试剂盒、细胞内自噬溶酶体探针等手段检测细胞内的应激性改变;最后,采用Western Blotting、质粒转染、细胞免疫荧光、透射电镜、激光扫描共聚焦显微镜等动态及静态检测并分析纳米氧化锌对细胞内自噬体的数量的影响,以及对自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin1、线粒体自噬相关蛋白PINK 1、Parkin表达水平的影响。结果1.纳米氧化锌原始颗粒呈六棱柱形,颗粒原始尺寸50nm左右,水合粒径500.8 nm左右,Zeta电位32.9mV。衍射图谱分析结果与标准品基本一致。2.纳米氧化锌致CAL27细胞抑制率与浓度成正相关关系,计算得出50%抑制浓度为25 μg/mL。3.25μg/mL纳米氧化锌可引起细胞内活性氧水平显著升高、线粒体膜电位减少、细胞内自噬体荧光颗粒数量增加,且与刺激时长有相关关系;差异均有统计学意义。(均P0.01)4.25μg/mL纳米氧化锌刺激细胞不同时长后,细胞免疫荧光结果显示,LC3II、PINK1荧光颗粒数量增加(P0.05)。Western Blotting结果显示自噬相关蛋白LC3II、Beclin1、PINK1表达显著增加,P62表达显著下调(P0.05)。线粒体自噬相关蛋白Parkin在胞浆的表达下降,而在线粒体的表达上调。激光扫描共聚焦结果发现处理组细胞内存在较多的PINK1与GFP-LC3荧光颗粒共定位(P0.05)。透射电镜结果在处理组细胞内发现较多双层膜结构的自噬体和肿胀变形的线粒体。结论1.50 nm粒径纳米氧化锌颗粒对CAL 27细胞具有一定的细胞毒性。2.50 nm纳米氧化锌颗粒可以引起CAL 27细胞线粒体损伤和氧化应激。3.PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬的过度激活可能在纳米氧化锌引起的CAL 27细胞凋亡中起关键作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.86
【图文】：

自噬,双重角色,线粒体

越来越多的研宄表明，线粒体自噬异常在肿瘤的发展过程中和肿瘤耐药性逡逑产生过程中扮演重要的角色［２Ｇ］。线粒体自噬正在成为肿瘤治疗的一个潜在靶点逡逑线粒体自噬在癌细胞发生发展中扮演着双重角色（图２），某些肿瘤细胞中，逡逑过度的诱导线粒体自噬会导致细胞的凋亡，可以通过激活线粒体自噬的方式来逡逑阻止结肠炎癌症的进展［２２］。而也有研究发现，在某些肿瘤细胞中诱导的线粒体自逡逑噬却促进肿瘤的发生和进展［２１，２３＞］。因此线粒体自噬在肿瘤的治疗中宄竟应该激逡逑发还是抑制，取决于肿瘤的类型。逡逑３逡逑

透射电镜,透射电镜,图像,颗粒表征

逦第一章纳米氧化锌颗粒表征逦逡逑２结果逡逑２．１逦ＺｎＯ邋ＮＰｓ原始尺寸及颗粒表面形貌逡逑从ＳＥＭ检测获得的图像可以看出，ＺｎＯ邋ＮＰｓ呈现出纵向观为柱形、横向观逡逑为六边形的表面形貌特点，故颗粒形状为典型的六棱柱形，从ＴＥＭ检测获得的逡逑图像可以看出，ＺｎＯ邋ＮＰｓ的原始尺寸在５０邋ｎｍ左右（图１－１）。逡逑

【参考文献】