mPDT对直肠癌的杀伤效应及其机制的体内外研究

发布时间：2020-06-23 06:58

【摘要】：结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)是人类主要恶性肿瘤之一。近年来随着光纤、内窥镜等技术的发展,光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)在治疗结直肠癌等腔隙肿瘤中得到广泛应用。但临床治疗时氧消耗和光敏剂水平的不匹配,使得PDT的疗效不甚理想。舒缓型光动力疗法(metronomic photodynamic therapy,mPDT)是指低剂量长时间光照射使氧耗与光敏剂更好地匹配,以提高肿瘤细胞的选择性凋亡而优化治疗效果的PDT疗法。目的:本文将通过研究ALA诱导的mPDT在体内外对人直肠癌细胞的杀伤作用和杀伤机制,旨在为直肠癌治疗寻求一种高效疗法。方法:1.体外实验:以人结直肠癌细胞系SW837为实验对象,MTT法对比分析急性光动力疗法(acute photodynamic therapy,aPDT)和 mPDT 在不同 ALA 浓度(0.125、0.25、0.5、1、2mM)、不同光功率密度(0.2、0.4、0.8mW/cm2)、不同光能量密度(2.5、5J/cm2)下对细胞存活率的影响;在相同能量密度下,评价aPDT和mPDT处理后不同时间点的细胞凋亡(Annexin V-FITC/PI双染法)和自噬(Ad-GFP-LC3B试剂盒);同时透射电镜观察两种PDT处理后3h和12h的细胞超微结构;Western Blot检测凋亡和自噬相关蛋白的表达。2.体内实验:设计研制用于在体直肠癌mPDT治疗的栓剂试剂盒(包括ALA栓剂和LED直肠栓光源),分析其对兔原位直肠肿瘤的杀伤效果。以ALA、36型半合成脂肪酸甘油酯和氮酮为原料制备ALA栓剂(10 wt%);以透明环氧树脂封装LED芯片和相应的电路来构成LED栓剂。将VX2细胞注射至兔直肠粘膜下层,建立原位肿瘤模型,肿瘤生长至1cm3左右时进行mPDT处理:ALA栓剂(0.8g)经直肠给药30min后以功率密度为20mW/cm2的LED栓剂照射1h;每天1次,连续治疗3天。mPDT后第7天和第14天分别用磁共振成像检测肿瘤生长情况,并于第14天检测后处死动物取肿瘤组织,作HE和TUNEL染色分析。结果:1.相同能量密度下,mPDT引起的细胞死亡相比aPDT发生得更早,杀伤效率更高。mPDT和aPDT(5J/cm2)处理后3、6、12、24h的细胞存活率分别是:35.2%、32.4%、27.6%、31.6%vs.85.7%、71.1%、67.8%、42.1%;2.相比aPDT,mPDT在处理后早期即引起较高的细胞凋亡。mPDT和aPDT(5J/cm2)处理后3、6、12、24h的细胞凋亡率分别是43.2%、47.3%、54.7%、50.3%vs.14.6%、17.6%、27.1%、53.2%。与 aPDT 处理组相比,mPDT 处理组中cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达在处理后3h和6h显著高,分别为2.45、5.83 倍(3h)和 2.47、1.21 倍(6h)。3.相比aPDT,mPDT引起更早的细胞自噬。mPDT处理后3h,细胞自噬达到峰值(20%),aPDT处理后3h和12h时,分别出现相对小的自噬峰(自噬率为14.1%和15.8%)。TEM结果显示,mPDT处理后3h,细胞内即出现大量晚期自噬体,而aPDT处理后3h-12h,则主要是早期自噬体。Western Blot结果表明,在mPDT处理后3h,与aPDT相比,LC3-Ⅱ/Ⅰ的比率前者是后者的2.15倍。4.研制的mPDT栓剂试剂盒满足实验要求。ALA栓剂于37℃可在30min内软化无硬心,直肠给药后靶向聚集在肿瘤部位;LED直肠栓光源的电功率为0.2W,输出的光功率密度为20mW/cm2,能实现长时间稳定输出。5.mPDT在体肿瘤治疗的总体有效率是60%。mPDT治疗后第7天,肿瘤体积降低到50%左右,第14天时几乎消除。HE染色结果显示,只有6.16%的肿瘤组织在mPDT治疗后残留;TUNEL染色结果显示,mPDT处理后细胞凋亡率为 18.9%。结论:体外和体内实验均显示与aPDT相比,ALA-mPDT对直肠癌细胞有显著的的抑制效果,发生于早期的严重的凋亡和自噬是其主要作用机制。mPDT在人直肠癌的临床治疗中可能成为一种新的优于aPDT的选择,PDT栓剂试剂盒将很大程度上改善目前光动力治疗的效果。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.37
【图文】：

自噬,细胞死亡,生化特征,形态学

细胞压力的生存反应。但是，研究也表明，自噬的发生有时会导致细胞死亡７〃５。逡逑此外，自噬性的细胞死亡具有不同于细胞凋亡和坏死的形态学和生化特征Ｍ。如逡逑图１．３所示，即为自噬过程中关键的细胞变化。逡逑７逡逑

过程图,自噬,细胞,过程

ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｂｌｅｂｓ逦ｖ９逡逑图１．２细胞凋亡过程６５逡逑目前，大量研究表明，ＰＤＴ处理后引起的细胞死亡主要是通过凋亡和坏死逡逑介导的。与坏死（Ｎｅｃｒｏｓｉｓ，一种由急性细胞损伤导致的创伤性细胞死亡）不同，逡逑细胞凋亡是一种高度调节和控制的过程，在机体生命周期中具有优势。细胞凋亡逡逑一旦开始就不能停止，这是一个高度调控的过程。细胞凋亡可以通过下列两条途逡逑径之一进行：在内源性途径中，线粒体由于外膜通透性发生变化而向细胞内释放逡逑细胞色素ｃ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ，Ｃｙｔｃ）及其他调亡因子，这些因子与ｃａｓｐａｓｅ９前体结逡逑合形成凋亡复合物从而激活ｃａｓｐａｓｅ邋９并启动下游的ｃａｓｐａｓｅ级联反应在外源逡逑性途径中，细胞膜表面的死亡受体（Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ等）与相应的死亡配体（主要逡逑指肿瘤坏死因子家族成员）结合后激活ｃａｓｐａｓｅ邋８

【参考文献】