HIF-2α介导乳腺癌干细胞药物敏感性的作用与机制研究

发布时间：2020-06-24 11:55

【摘要】：目的:乳腺癌是世界上女性发病率最高的恶性肿瘤。随着研究的不断深入,肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)理论为乳腺癌的治疗提供了新的思路。CSCs是存在于肿瘤细胞中具有很强的自我更新能力、处于静止期、高表达干性标记物、抗凋亡、高表达耐药蛋白、具有无限增殖及分化潜能的一小群特殊细胞。目前已在多种实体肿瘤如乳腺癌、大肠癌、肝癌、脑癌等癌症中发现。靶向乳腺癌肿瘤干细胞(Breast cancer stem cells,BCSCs)对临床设计更有效的合理化疗方案具有重要意义。在实体瘤中,CSCs常常处于低氧微环境,低氧龛微环境往往诱导低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor,HIFs)的积累。HIFs是由basic helix-loop-helix-Per-ARNT-Sim组成的转录因子,包含一个氧含量敏感的?亚单位异构体(HIF-1?,HIF-2?,HIF-3?)与一个?亚单位配体(ARNT)。虽然HIF-1?与HIF-2?在结构上高度同源,但生物学功能却不完全相同。近年来的研究发现在肿瘤干细胞中,HIF-1?与HIF-2?参与调节干细胞干性,尤其HIF-2?对CSCs干性的调节作用备受关注,但HIF-2?如何发挥功能介导干性及耐药性仍未有相关报道。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是细胞内质网生理功能发生紊乱的一种亚细胞器病理过程,通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)介导的细胞内信号转导通路来完成。研究报道UPR通路的激活增强了多种肿瘤细胞的耐药性。近年有研究报道,HIF-2?及UPR通路与肿瘤的发生及耐药密切相关。但在乳腺癌干细胞中HIF-2?是否介导UPR通路调节对传统化疗药的耐药性仍未见报道。(-)-Epigallocatechin-3-gallate(EGCG)是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体,是茶多酚生物活性的主要成分,具有抗氧化、抗衰老等作用。大量研究发现,在不同的肿瘤动物模型及细胞系中,EGCG做为抗氧化剂可通过调节HIF-1?与HIF-2?发挥抑制增殖、诱导凋亡、降低化疗药耐药等作用。但是,EGCG是否通过调控HIF-2?调节乳腺癌肿瘤干细胞的耐药性仍未见报道。Wnt、Notch信号通路是两条高度保守与干细胞自我更新维持密切相关的通路。目前关于HIF-2?与Wnt/β-catenin、Notch通路相互作用,调控肿瘤发生发展的报道不一致,其作用与BCSCs干性和药物敏感性的关系也未见报道。因此,本实验通过无血清非粘附悬浮培养MCF-7和T47D乳腺癌细胞,富集具有BCSCs特性的乳腺癌球囊细胞MCF-7 MS和T47D MS,研究HIF-2?对乳腺癌干细胞干性及药物敏感性的调控作用,以及内质网应激UPR通路和Wnt通路、Notch通路在HIF-2?调控乳腺癌细胞干性及药物敏感性中的作用机制,为研究乳腺癌干细胞耐药性形成与逆转的新切入点提供理论与实验依据。方法:采用无血清非粘附悬浮培养MCF-7和T47D乳腺癌细胞,富集MCF-7MS和T47D MS乳腺癌球囊细胞;通过流式检测干性标志物CD44~+CD24~-细胞比例,Western blot检测干细胞标志物OCT4及Nanog蛋白表达水平,软琼脂集落形成检测自我更新能力,Transwell迁移侵袭实验检测细胞迁移侵袭能力,恢复血清培养观察球囊细胞的再分化潜能,裸鼠成瘤实验检测在体致瘤性,对MCF-7 MS和T47D MS乳腺癌球囊细胞的自我更新、侵袭迁移、分化及致瘤性等干性进行鉴定。慢病毒转染及筛选构建HIF-2α过表达的MCF-7和T47D稳转乳腺癌细胞株,及HIF-2α沉默的MCF-7 MS和T47D MS稳转细胞株,分别通过qRT-PCR和Western blot检测HIF-2α及下游靶基因HES-1、VEGFA表达,验证转染是否成功。通过CCK-8assay检测对紫杉醇(PTX)的药物敏感性变化,考察干扰HIF-2α对乳腺癌干细胞药物敏感性的影响;软琼脂集落形成检测细胞克隆形成能力的变化,血清分化实验考察贴壁分化能力,Western blot检测OCT4、Nanog、CK14的表达变化,考察HIF-2α对乳腺癌干细胞干性的影响。Western blot检测沉默HIF-2α后MCF-7 MS和T47D MS细胞,内质网应激通路蛋白GRP78、IRE1、PERK、XBP1s、p-IRE1、p-PERK的表达影响;耐药蛋白P-GP的表达变化、LC-MS/MS检测细胞内PTX药物蓄积,mitoSOX染色检测细胞内mtROS水平;qRT-PCR检测SOD2的表达水平。探讨内质网应激在HIF-2α调控乳腺癌干细胞干性及药物敏感性中的作用。通过裸鼠皮下接种稳转HIF-2α沉默慢病毒的MCF-7 MS细胞,构建HIF-2α沉默裸鼠移植瘤模型,考察HIF-2α沉默对裸鼠移植瘤生长及对PTX药物敏感性的影响;通过免疫组织化学染色检测瘤组织HIF-2α、GRP78、P-GP表达;Western blot检测瘤组织UPR通路相关蛋白表达,LC-MS/MS检测组织内PTX药物蓄积,在体考察HIF-2α对乳腺癌细胞干性和药物敏感性的影响及与UPR通路的关系。EGCG联合PTX处理MCF-7 MS细胞,MTT实验检测对PTX药物敏感性的变化。Western blot检测HIF-2?、GRP78的表达。通过裸鼠皮下接种MCF-7 MS细胞,构建裸鼠移植瘤模型,同时给予EGCG和PTX腹腔注射给药,考察EGCG联合PTX对裸鼠移植瘤生长及对PTX药物敏感性的影响。通过免疫组织化学染色检测组织HIF-2α、GRP78表达;在体考察EGCG对乳腺癌干细胞的药物敏感性的影响及对HIF-2α的调控。MOE预测及OWLS体外亲合力试验,考察EGCG与HIF-2?的体外结合情况及具体的绑定位点。Western blot检测过表达HIF-2α的MCF-7和MDA-MB-231细胞Wnt、Notch通路相关蛋白表达;MTT实验检测Wnt通路阻断剂DKK-1、Notch通路阻断剂L685,458处理对HIF-2α过表达的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞在PTX处理后细胞生存率的改变;通过流式检测细胞凋亡率的改变,通过软琼脂集落形成实验检测细胞克隆形成能力的改变。通过Western blot检测过表达HIF-2α后MCF-7和MDA-MB-231细胞并给与通路抑制剂DKK-1、L685,458后通路的Wnt、Notch通路蛋白的表达。考察HIF-2?是否通过调控Wnt,Notch通路调控乳腺癌MCF-7,MDA-MB-231细胞的耐药性。结果:1.MCF-7和T47D乳腺癌细胞在无血清非粘附悬浮培养条件下可富集形成MCF-7 MS和T47D MS乳腺癌球囊细胞;与亲本的MCF-7和T47D细胞比,MCF-7MS和T47D MS球囊细胞具有高比例的CD44~+CD24~-细胞,高表达干细胞标志物OCT4和Nanog,具有强的形成单克隆细胞球的能力、迁移和侵袭能力、分化潜能及在体致瘤性。2.MCF-7 MS和T47D MS细胞对PTX耐药,且高表达HIF-1α/HIF-2α,尤其是HIF-2α。慢病毒转染shRNA-HIF-2α质粒,可沉默MCF-7 MS和T47D MS细胞HIF-2α的表达,增加对PTX的敏感性,增加细胞内PTX,且沉默HIF-2α可降低MCF-7 MS和T47D MS细胞克隆形成能力及干细胞标志物OCT4、Nanog的表达;慢病毒转染HIF-2α-cDNA质粒,MCF-7和MDA-MB-231细胞过表达HIF-2α,降低对PTX的敏感性,且过表达HIF-2α可增强MCF-7和MDA-MB-231细胞克隆形成能力及干细胞标志物OCT4、Naong的表达。3.沉默HIF-2α明显降低了MCF-7 MS和T47D MS细胞UPR通路相关蛋白及P-GP的表达;降低了SOD2 mRNA的表达、mtROS表达增加;加入mtROS抑制剂mitoTEMPOL后HIF-2α沉默诱导的药物敏感性增强被抑制,细胞内mtROS水平下降且UPR通路的抑制得到逆转。4.沉默HIF-2α的MCF-7 MS细胞荷瘤鼠瘤体积和瘤重均降低,且增强了荷瘤鼠对PTX的药物敏感性;沉默HIF-2α的MCF-7 MS细胞荷瘤鼠瘤组织的HIF-2α和GRP78、UPR通路相关蛋白表达下降,P-GP蛋白表达降低,组织内PTX积蓄增加。5.EGCG联合PTX处理MCF-7 MS细胞,可增强MCF-7 MS细胞对PTX的药物敏感性,抑制自我更新能力;并抑制HIF-2α及GRP78的表达。EGCG可以靶向结合HIF-2αPAS区域,抑制HIF-2α的转录活性。6.过表达HIF-2α的MCF-7、MDA-MB-231细胞,Wnt通路和Notch通路蛋白表达均明显增高;Wnt通路抑制剂DKK-1、Notch通路抑制剂L685,458逆转了HIF-2α诱导的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞对PTX的耐药;抑制Wnt、Notch通路活性后,过表达HIF-2α诱导的MCF-7和MDA-MB-231细胞集落形成能力的增强被明显抑制;凋亡细胞比例明显增加。结论:1.通过无血清非粘附悬浮培养乳腺癌MCF-7和T47D乳腺癌细胞可成功富集具有强自我更新能力、侵袭迁移能力、分化潜能及在体致瘤性等乳腺癌干细胞特性的MCF-7 MS和T47D MS乳腺癌球囊细胞。2.沉默HIF-2α能抑制乳腺癌干细胞对PTX的耐药性。3.HIF-2α通过调控mtROS介导内质网应激UPR通路影响乳腺癌干细胞对PTX的耐药性。4.EGCG通过靶向结合HIF-2αPAS区域,抑制HIF-2?转录活性,增强PTX对MCF-7 MS细胞的杀伤作用。5.HIF-2α通过激活Wnt、Notch通路增强乳腺癌细胞干性及对PTX的耐药。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

标准曲线,蛋白质含量测定,标准曲线

图 1 蛋白质含量测定标准曲线蛋白样品处理：用 6×蛋白上样缓冲液处理样品，根据定量得的蛋白浓量 30 μl:50 μg 蛋白样品，不足 30 μl 用 PBS 补齐，金属浴 100 ℃ 10 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳：洗净玻璃板，烘架上；配置 8 %、10 %、12 %分离胶和 5 %浓缩胶，分别先后灌注分，立即插入干净的梳子，室温聚合 15 min，待浓缩胶凝固，把胶架置加入 1×电泳缓冲液 500 mL，浸泡 20 min 后，上样；恒压 60 V，至移至浓缩胶和分离胶的分界处，调节电压至 100 V，待溴酚蓝指示剂部 1 cm 处，停止电泳；将凝胶取出放入回收的转膜缓冲液中。恒压湿转法转膜：切胶，剪取相同大小的 0.45 μm/ 0.22 μm PVDF 膜30 s，转膜缓冲液浸泡 5 min，将 PVDF 膜覆盖于凝胶上相应目标位置与转膜夹大小相同的滤纸，转移缓冲液浸湿，用玻璃棒赶尽气泡；按海

干性,细胞,表达差异,标记物

14图 1-1. MCF-7 MS 细胞干性鉴定(A)光学显微镜下 MCF-7 细胞与 MCF-7 MS 细胞形态学差异；(B)软琼脂克隆形成实验检MCF-7、MCF-7 MS 细胞自我更新能力；(C)流式检测 MCF-7、MCF-7 MS 细胞干性标记NANOG 的表达差异；(D)WB 检测 MCF-7 、MCF-7 MS 细胞干性标记物 OCT4 的表达(E)血清恢复实验检测 MCF-7 MS 细胞分化能力的恢复；* P<0.05，** P<0.01，*** P<0MCF-7 细胞相比。

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