基于转录因子FOXM1调控下的抗非小细胞肺癌上皮间质转化的机制研究

发布时间：2020-06-25 01:39

【摘要】：目的:肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其中80%是非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC),晚期患者可出现全身性的转移,五年生存率极低。而上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是癌症发生发展中的重要过程,是NSCLC发生侵袭转移的根源。研究表明肿瘤细胞在EMT过程中,大量转录因子向核内聚集而促进了EMT相关蛋白表达。近年研究发现叉头框转录因子(Forkhead box,FOX)家族在调控EMT过程中发挥了重要作用,其中FOXM1介导了多种肿瘤细胞的恶性进程,然而其对NSCLC细胞EMT的调控作用,尤其是对E-cadherin编码基因CDH1的转录调控作用尚不明确。本文以FOXM1为研究对象,探讨其在调控NSCLC细胞EMT过程中的机制及FOXM1特异性抑制剂硫链丝菌素对EMT的干预作用。方法:(1)通过FOXM1蛋白表达水平改变探讨其调控NSCLC细胞EMT的作用:HE染色观察过表达FOXM1后细胞的形态学变化;划痕实验、Transwell小室实验分别测定过表达、敲减FOXM1后细胞迁移和侵袭能力的变化;Western-Blot分析过表达、敲减FOXM1对EMT相关标志物表达的影响。(2)分子机制探讨FOXM1对EMT相关标志物的转录调控:双荧光素报告酶实验验证FOXM1对CDH1启动子的调控;核转录因子免疫共沉淀实验(Ch IP)验证FOXM1对CDH1基因启动子的结合;在过表达FOXM1细胞中敲减Snail,通过双荧光素报告酶、免疫荧光整体揭示FOXM1对EMT标志物的转录调控。(3)FOXM1抑制剂硫链丝菌素体外抗NSCLC细胞EMT作用:MTT实验测定硫链丝菌素对NSCLC细胞活力的影响;克隆形成实验研究硫链丝菌素对NSCLC细胞克隆形成能力的影响;细胞形态学观察硫链丝菌素对TGF-β1诱导的EMT过程的作用;细胞迁移实验、Transwell小室实验测定硫链丝菌素对细胞迁移和侵袭的作用;Western-Blot分析硫链丝菌素对NSCLC细胞EMT相关蛋白表达的影响。结果:(1)GSEA分析以及在NSCLC细胞中的EMT蛋白、FOXM1表达检测表明,FOXM1与EMT具有一定的相关性;过表达FOXM1后的细胞呈现上皮-间质中间形态,而非完全的间质化形态;过表达FOXM1的A549细胞迁移能力和侵袭能力增强;N-cadherin,Snail,Vimentin的蛋白表达水平升高,E-cadherin的表达水平降低。在H1975细胞中敲减FOXM1的表达抑制了细胞侵袭迁移能力,E-cadherin表达水平升高,N-cadherin,Snail,Vimentin表达水平降低。(2)双荧光素报告酶实验表明FOXM1对于CDH1-2000-promoter荧光素报告载体具有抑制作用;Ch IP结果证实了FOXM1能够内源性结合于CDH1基因启动子;在过表达FOXM1的细胞中敲减Snail后,E-cadherin的表达恢复。(3)MTT结果显示硫链丝菌素对NSCLC细胞增殖具有抑制作用;克隆形成实验表明硫链丝菌素能抑制NSCLC细胞的克隆形成能力;TGF-β1诱导的EMT过程中伴随着FOXM1的表达增加,细胞形态学发现这一过程能被硫链丝菌素所逆转;细胞迁移实验、Transwell小室实验表明硫链丝菌素能够抑制TGF-β1诱导而增强的细胞迁移和侵袭的作用,Western-Blot分析表明,硫链丝菌素能够下调TGF-β1所诱导的FOXM1,N-cadherin,Snail,Vimentin表达升高,阻断TGF-β1诱导的E-cadherin表达降低。结论:过表达FOXM1能够促进NSCLC细胞EMT过程,而降低FOXM1的表达能够抑制这一过程。FOXM1能够抑制CDH1的转录,并能够促进Snail间接对CDH1发挥转录抑制作用来介导EMT过程。FOXM1抑制药物硫链丝菌素对NSCLC细胞增殖、克隆及EMT过程具有抑制作用。以上结果表明可以通过改变FOXM1的表达来干预EMT过程。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

标志物,转录因子

图 1. EMT 及其标志物转化Fig 1. EMT and switch its biomarkers (Scanlon et al, Journal of dental research, 2013).对于 EGFR、ALK 基因靶向药物无法获益的 NSCLC 患者，或对其产生获得耐药的，极易发生 EMT 而出现复发和转移。研究表明，EMT 也是介导肿瘤干胞特性获得的重要来源，抗 EMT 策略配合靶向药物的使用，往往能够比单一使靶向药物发挥更加期待的效果[8]。因此，探讨 EMT 关键效应分子，挖掘逆转 EM新机制，能够为建立 NSCLC 远处转移的早期预警和辅助靶向治疗方案提供重要理论基础。三、转录因子FOXM1 介导恶性肿瘤演变过程的国内外研究进展不论是天然抗性还是获得耐药肿瘤细胞往往都存在着异常的转录特征，并参与肿瘤转移多个生物学过程调节的转录基因都出现了表达改变的情况，其中重要的便是 EMT 上游的转录因子[9, 10]。因此，我们不能忽视转录因子在 NSCL发生发展中的重要作用。

生物学过程,风险,关键分,风险因素

图 2. FOXM1 参与了肿瘤发展的生物学过程及其表达风险的 meta 分析Fig 2. FOXM1 participate in multiple biological process in tumor progression (Bella et al,Seminars in Cancer Biology, 2014) and its meta analysis of expression risk (Dai et al, DiseaseMarkers, 2015).四、异常表达FOXM1 是NSCLC 患者的重要风险因素在 NSCLC 的发生发展中，关键分子的出现对恶性复发及转移的指示至关重要。FOXM1 的异常表达近年被不断从肿瘤样本中鉴定出来，由 Dai 等对该类研究进行了大量收集并进行 meta 分析[19]（图 2 右），数据表明 FOXM1 可以作为判定

【参考文献】