共刺激分子B7-H3在肝细胞癌的表达及相关机制研究

发布时间：2020-06-26 00:54

【摘要】：研究目的：阐明肝细胞癌组织表达共刺激分子B7-H3的特点及与患者临床特征、预后的关系,探讨B7-H3分子对肝癌细胞生物学行为的影响及其机制。研究方法：1.通过免疫组化检测116例肝癌患者组织B7-H3的表达水平和特点,并比较不同分组间B7-H3的表达差异。通过Kaplan-Meier生存分析比较不同B7-H3表达水平患者总体预后的差异并采用Cox风险模型进行预后因素分析。2.构建B7-H3-shRNA沉默质粒,下调肝癌细胞系HepG2和SMMC7721的B7-H3基因表达,通过MTT实验和ELISA凋亡试剂盒检测细胞增殖能力和凋亡水平变化,通过划痕实验检测细胞平面运动能力变化,通过transwell实验检测对细胞侵袭能力的影响。3.通过、Western blot实验检测沉默B7-H3基因后侵袭相关分子MMP-2、 MMP-9, EMT相关分子E-cadherin、Vimenti、N-cadherin,以及JAK/Stat信号通路分子p-stat3、p-JAK2和EMT相关转录因子Slug和Snail的表达变化。4.通过免疫组织化学方法检测CD68阳性肿瘤浸润巨噬细胞在116例肝癌患者组织中的分布及特点,分析TAMs浸润数量与B7-H3表达的相关性,以及TAMs数量与预后的关系。5.分别将HepG2细胞与PMA诱导的THP-1细胞采用接触共育和非接触共育培养,通过RT-PCR和western b lot实验检测M1型巨噬细胞特征性分子HLA-DR、iNOS和TNF-α,以及M2型分子Argl、VEGF和CCL22的表达。6.在接触共育培养体系中,采用B7-H3-shRNA沉默质粒下调HepG2细胞B7-H3基因表达,通过RT-PCR和western blot实验检测M1型分子HLA-DR、iNOS和]TNF-α,M2型分子Argl、VEGF口CCL22的表达。并进一步通过加入外源重组B7-H3蛋白,观察是否可逆转沉默B7-H3对巨噬细胞极化的影响。研究结果：1.116例肝癌组织标本中,109例可检测到强弱不等的B7-H3表达。B7-H3的表达水平在不同TNM分期及按是否存在淋巴结转移分组,组间有显著性差异。生存分析提示B7-H3低表达组有更高的生存率,B7-H3高表达提示预后不良。2.采用B7-H3-shRNA沉默质粒下调HepG2和SMMC7721细胞B7-H3基因表达后：1)细胞增殖和凋亡水平无明显变化；2)平面移行能力和侵袭能力显著下降；3)EMT机制受到抑制,表现为E-钙粘蛋白表达升高,而波形蛋白、N-钙粘蛋白表达下降；4)MMP-2、MMP-9的表达水平和活性下降；5) p-stat3和p-JAK2及EMT相关转录因子Slug的表达下调。3.116例肝癌组织标本中,94.8%可检测到以CD68为标志的TAMs浸润,显著高于癌旁和正常肝组织,且浸润水平与TNM分期、淋巴结转移和预后密切相关。B7-H3的表达水平和TAMs的浸润数量呈显著正相关。6.采用非接触共育培养和接触共育培养,HepG2细胞均可诱导THP-1来源的巨噬细胞发生M2亚型极化,表现为HLA-DR、iNOS和TNF-α表达下降,而Arg1、VEGF和CCL22表达升高,其中接触共育的诱导作用更为明显。7.采用B7-H3-shRNA沉默质粒下调B7-H3基因表达可抑制HepG2细胞诱导THP-1来源的巨噬细胞发生M2亚型极化,而加入外源重组B7-H3蛋白可一定程度逆转siRNA的沉默作用。结论：1.B7-H3在肝癌组织表达明显升高,且与肿瘤分期、转移和预后密切相关。2.B7-H3的表达增强了肝癌细胞的侵袭、转移能力。3.B7-H3对肝癌的侵袭、转移能力的影响与通过JAK-2/Stat-3/Slu g通路介导上皮间质转化机制有关。4.肝癌组织肿瘤相关巨噬细胞的浸润水平与疾病进程和预后密切相关,且与组织B7-H3的表达呈显著正相关。5.肝癌细胞可通过B7-H3诱导肿瘤相关巨噬细胞发生M2亚型极化。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

【参考文献】