免疫营养素及肠道菌群对结直肠癌治疗的影响机制研究

发布时间：2020-06-25 15:06

【摘要】：第一部分免疫营养素干预小鼠结肠癌模型化疗效果及肠道菌群偏离情况的研究研究背景:结直肠肿癌的放化疗最常见的副反应是胃肠道并发症,主要表现为胃肠动力和肠道菌群的紊乱及肠屏障受损。免疫营养素在营养支持、调节免疫和维护肠道菌群、肠粘膜屏障功能等方面有着重要的作用。许多研究表明免疫营养素联合化疗在肿瘤治疗中起重要作用。补充免疫营养素可以改善炎性肠病、部分肝切除动物的肠道菌群和肠屏障功能,而对化疗导致的肠屏障损害的作用报道较少,其在结直肠癌治疗中的作用也有待进一步研究。目的:通过给化疗小鼠模型补充谷氨酰胺、n-3多不饱和脂肪酸和益生元,探讨补充不同免疫营养素对荷瘤小鼠化疗效果、维持肠道菌群结构的作用,研究其改善肠道菌群紊乱的机制,为将来免疫营养素在结直肠癌临床治疗中的应用奠定研究基础。方法:30只雌性BALB/c小鼠皮下注射CT26小鼠结肠癌细胞系,构建荷瘤小鼠模型。将荷瘤小鼠随机分为五组:第1组无化疗干预对照组(Control,CON,n=6);第2组化疗+生理盐水干预组(Normal saline,NS,n=6);第3组化疗+谷胺酰胺干预组(Glutamine,GLN,n=6);第4组化疗+n-3多不饱和脂肪酸干预组(Polyunsaturated fatty acids,PUFA,n=6);第 5 组化疗+益生元干预组(Prebiotics,PRE,n=6)。干预前(Baseline,BAS)和各组干预2周后,取小鼠新鲜粪便提取DNA,通过16S rRNAMiseq测序检测小鼠粪便肠道菌群。结果:接受化疗的NS组小鼠粪便中厚壁菌门(Firmicutes)和乳酸菌属(Lactobacillus)含量显著高于基线水平(BAS)和CON组,而拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌属(Bacteroides)显著低于基线水平(BAS)和CON组小鼠(P0.05)。PUFA组小鼠粪便中拟杆菌门(Bacteroidetes)含量显著高于NS组,而厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)显著低于NS组小鼠(P0.05)。GLN组和PRE组小鼠粪便菌群在门的水平上与NS组均无显著差异(P0.05)。接受化疗干预的NS组、GLN组、PUFA组、PRE组小鼠成瘤体积较无化疗干预的CON组明显缩小(P0.05);接受免疫营养素干预的小鼠中,PUFA组小鼠成瘤体积较NS组明显缩小(P0.05),GLN组、PRE组小鼠与NS组小鼠成瘤体积无明显差别(P0.05)。结论:5-Fu化疗导致小鼠肠道菌群结构改变,拟杆菌门(Bacteroidetes)水平降低,厚壁菌门(Firmicutes)水平升高。而补充n-3PUFAs可以修复化疗导致的肠道菌群紊乱,提升拟杆菌门(Bacteroidetes)含量,降低厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)含量,提高化疗效果。第二部分肠道微环境变化对结直肠癌术后患者肠道功能影响的研究背景:胃肠道手术患者术后经常出现胃肠道功能相关并发症,接受结直肠癌根治手术的患者经常表现为腹泻或麻痹性肠梗阻。许多研究表明这些并发症与手术应激、围手术期肠道准备、术后禁食以及术后肠道菌群失调相关。但目前关于结直肠癌手术后肠道菌群结构改变与手术并发症关系的研究很少,其在术后肠道功能恢复中的作用机制值得进一步研究。目的:分析结直肠癌患者手术前后的粪便菌群结构差异,探讨肠道菌群结构变化在结直肠癌术后肠道功能恢复中的作用。材料与方法:选取在北京协和医院接受择期手术结直肠癌患者,根据患者术后肠道功能恢复情况分为术后肠道功能正常组(正常组)和术后腹泻/肠麻痹组(腹泻组)。分别于术前、术后5-7天留取新鲜粪便提取DNA,通过16S rRNA Miseq测序检测粪便肠道菌群。分别于术后第一天(POD1)、第三天(POD3)采集空腹血,留取血清标本,应用ELISA方法检测血清中炎症因子(TNF-α,IL-6,IL8)水平。比较正常组与腹泻组术前、术后肠道菌群结构差异及术后血浆炎症因子水平的差异,分析肠道菌群结构改变与术后肠道功能的相关性。结果:共纳入38例择期结直肠癌手术患者,其中正常组27例,腹泻组11例。两组间术前粪便主要菌群丰度无显著差异,包括厚壁菌门(Firmicutes,67.05%VS 58.14%,P0.05),拟杆菌门(Bacteroidetes,21.01%VS 11.75%,P0.05),变形菌门(Proteobacteria,5.36%VS 18.39%,P0.05)和放线菌门(Actinobacteria,5.65%VS 10.03%,P0.05)。术后粪便菌群检测结果显示,正常组患者粪便中拟杆菌门(Bacteroidetes,34.20%VS 14.47%,P0.05),拟杆菌属(Bacteroides,21.40%VS8.68%,P0.05)和 Parabacteroides(21.40%VS8.68%,P0.05)比例显著高于腹泻组,而变形菌门(Proteobacteria,19.19%VS43.14%,P0.05)比例显著低于腹泻组;厚壁菌门(Firmicutes,41.88%VS39.52%,P0.05)和梭杆菌门(Fusobacteria,2.03%VS0.88%,P0.05)丰度在两组之间无显著差异。腹泻组患者POD1血清中炎症因子水平(IL-6)显著高于正常组,POD3两组间血清中炎症因子水平无显著差异。结论:正常组与腹泻组患者之间的术前粪便菌群结构无显著差异,术后粪便菌群结构存在显著差异。结直肠癌患者术后粪便菌群中拟杆菌门、拟杆菌属比例下降,变形菌门比例升高可能与术后腹泻等并发症相关。术后早期血清炎症因子检测可以对术后腹泻并发症起预警作用。第三部分加速康复外科理念下结直肠癌手术患者肠屏障及肠道微环境变化的研究研究背景:近十余年来加速康复外科(ERAS)理念在全球主要发达国家有了较为迅速的推广和应用,其在结直肠手术中的应用最为成功。与传统手术相比,ERAS模式下的结直肠手术简化了术前肠道准备,术后早期恢复饮食,减少手术患者肠道的创伤应激,早期恢复肠道功能,达到快速康复的目的。但目前支持ERAS理念的证据均来源于临床观察研究,ERAS模式对保护结直肠手术患者肠屏障功能和维护肠道微环境的研究少有报道。因此有必要开展相关研究,为ERAS理念的推广提供基础理论支持。目的:比较传统治疗模式与ERAS模式下择期结直肠手术的患者肠道菌群结构变化,探讨ERAS模式加速患者术后康复,改善患者术后肠道功能的机制。方法:选取在北京协和医院基本外科接受择期结直肠癌根治手术患者作为研究对象。根据术前肠道准备方式和术后营养支持手段的不同,将患者分为常规治疗模式组(对照组)和加速康复外科模式组(ERAS组)。分别于术前、术后5-7天留取新鲜粪便提取DNA,通过16S rRNA Miseq测序检测粪便菌群。分别于术后第一天(POD1)、第三天(POD3)采集空腹血,留取血清标本,应用ELISA方法检测血清中炎症因子(TNF-α,IL-6,IL8)水平。比较对照组与ERAS组术前、术后肠道菌群结构差异及术后血浆炎症因子水平的差异。结果:共纳入32例择期结直肠癌手术患者,其中对照组22例,ERAS组10例。两组间术前粪便主要菌群丰度无显著差异,包括厚壁菌门(Firmicutes,64.21%VS 64.11%,P0.05),拟杆菌门(Bacteroidetes,20.14%VS 18.14%,P0.05),变形菌门(Proteobacteria,8.23%VS 9.26%,P0.05)和放线菌门(Actinobacteria,6.71%VS 7.67%,P0.05)。术后粪便菌群检测结果显示,对照组与ERAS组患者粪便中厚壁菌门(Firmicutes,44.23%VS 46.37%,P0.05),变形菌门(Proteobacteria,26.98%VS16.52%,P0.05),拟杆菌门(Bacteroidetes,25.11%VS30.77%,P0.05),梭杆菌门(Fusobacteria,1.84%VS 1.37%,P0.05)和放线菌门(Actinobacteria,1.25%VS 1.22%,P0.05)丰度在两组之间无显著差异;对照组拟杆菌门(Bacteroidetes):变形菌门(Proteobacteria)比值显著低于 ERAS 组(0.93VS1.88,P0.05)。对照组患者POD1和POD3血清中炎症因子水平(TNF-α、IL-6、IL8)显著高于ERAS组。结论:与传统模式相比,ERAS模式可以提高结直肠手术患者术后粪便菌群中拟杆菌门含量,降低变形菌门含量,改善肠道菌群结构,从而加速患者术后肠道功能恢复。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34
【图文】：

长度分布,小组,序列,群体遗传学研究

图１．３．１有效序列长度分布逡逑小鼠肠道菌群结构多样性分析逡逑为了减少变量数目便于分析，同时最大可能减少由于测序错误造成的可能的种多样性，研究者们通常在微生物生态学研究中以分类操作单元（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｏｍｉｃ邋ｕｎｉｔ，ＯＴＵ）为单位进行研究。ＯＴＵ是在系统发生学或群体遗传学研究给某一个分类单元（品系，属，种、分组等）设置的同一标志。要了解一个序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作（ｃｌｕｓｔｅｒ）。类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个ＯＴＵ不同的相似度水平，对所有序列进行ＯＴＵ划分，通常对９７％的相似水平ＴＵ进行生物信息统计分析。逡逑本实验中以９７％的序列相似性为标准，在４１个样本中一共获得个６３６个ＯＴＵ。逡逑本的文库覆盖率（Ｇｏｏｃｆｓ邋ｃｏｖｅｒａｇｅ）均在９９％以上，显示出在此测序量下，逡逑

曲线,测序,多样性指数,多样性

逦中国医学科学院北京协和医学院博士研究生毕业论文逦逡逑测序量的深入，虽然大部分物种己经被检测到，但小鼠肠道内仍有少量新物种有待逡逑进一步测序发掘。而从Ｓｈａｎｎｏｎ多样性曲线来看，在测序量较少时，Ｓｈａｎｎｏｎ多样逡逑性指数的数值亦呈显著上升的趋势，而随着测序量的扩大，多样性指数数值增加的逡逑趋势逐渐变缓，且最终均达到饱和（图Ｌ３．２Ｂ）。这一结果提示，在此测序量下，动逡逑物肠道内微生物的多样性已经能够得到充分的检测。从各组数据来看，各组样本的逡逑稀疏曲线和Ｓｈａｎｎｏｎ多样性曲线都没有显著差异。逡逑Ｍｕｌｔｙ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋Ｒａｒ＾ａｃｔｉｏｎ邋Ｃｕｒｗｓ逦Ｍｕｌｔｙ邋ｓ？ｎｐｌｅｓ邋Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉ＊ｎｅｒ邋Ｃｕｒｖｅｓ逡逑

【参考文献】