GA6在肿瘤糖代谢中的作用及其机制

发布时间：2020-06-25 07:51

【摘要】：目的:恶性肿瘤已成为当今人类健康的主要威胁,随着新的治疗方法出现,新的问题也层出不穷。肿瘤发生的机制,耐药及新的抗肿瘤药物开发的问题亟待解决。缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible facto1,HIF1)其活性亚基HIF1α具有强大的功能,前期我们通过红外质谱实验发现HIF1α与GA6存在相互作用,GA6作为一种新发现的蛋白还未有报到与HIF1α有相互作用。本实验研究包括:GA6与HIF1α的相互作用及作用位点,从体外细胞到体内组织水平对GA6肿瘤生物学功能以及糖酵解关键酶的影响,以及与耐药存在的关系。将为恶性肿瘤的辅助治疗提供新的方向。方法:为了探究GA6与HIF1的关系我们通过构建可表达GA6和HIF1α的表达载体,并导入293T细胞内行免疫共沉淀确定其相互作用;纯化GA6截短突变体所表达的GST融合蛋白与HIF1a行GST pulldown实验,确定HIF1α在GA6上的结合情况;接下来在癌症细胞株中,利用Western blot检测其在GA6对HIF1α和糖酵解关键酶在蛋白水平上相互影响的关系,利用RT-PCR检测在GA6对HIF1α和糖酵解关键酶在转录水平上相互影响的关系,并利用小鼠在体内水平重复上述实验。最后通过培育的耐培美曲塞A549耐药株,探索GA6与耐药的关系。结果:通过免疫共沉淀确认GA6与HIF1α存在相互作用,进一步实验发现,HIF1α与GA6结合于其542-731段。通过敲低和过表达发现GA6可在蛋白和转录水平促进促进HIF1α的表达,并在基因敲除鼠体内得到认证。GA6具有促进肿瘤细胞生长调控糖酵解关键酶的生物学功能,与RAS的相互作用向我们展示了其与耐药有关的可能。结论:我们的实验发现了一个新的肿瘤细胞糖代谢调节因子——GA6,。GA6具有从转录,翻译,及生物学活性等方面调节糖酵解关键酶的功能,因其具有调节HIF1α的能力,其调节肿瘤糖代谢可能通过此途径完成。通过与K-RASG12D的结合增强展现了 GA6与耐药的相关性。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.2
【图文】：

免疫共沉淀,相互作用,转染

ＧＡ６真核表达载体，将这两种构建成功的表达载体（质粒）在２９３Ｔ细胞中共同转染，逡逑转染后２天收集细胞，鉴定转染成功后，利用免疫共沉实验对上述收集的细胞进行检逡逑测，发现ＧＡ６与ＨＩＦ－ｌａ发生特异性结合（图１．１）。由此说明，ＧＡ６是能与ＨＩＦ－ｌａ逡逑发生相互作用的蛋白。逡逑Ｍｙｃ－ＨＩＦｌａ逦＋逦＋逡逑ＦＬＡＧ－ＧＡ６逦－逦＋逡逑ＩＰ：邋ＦＬＡＧ逡逑ＩＢ：Ｍｙｃ逡逑Ｉｎｐｕｔ逡逑ＩＢ：Ｍｙｃ逡逑Ｉｎｐｕｔ逡逑ＩＢ：ＦＬＡＧ邋ｓ逡逑ｆ＊逡逑ＩＰ：ＦＬＡＧ逦毫灥＿逡逑ＩＢ：ＦＬＡＧ逡逑图１．１免疫共沉淀法发现ＧＡ６与ＨＩＦ－ｌａ发生相互作用逡逑２８逡逑

相互作用,细胞系,转染,结构域

解放军医学院硕士学位论文逡逑图１．１免疫共沉淀法发现ＧＡ６与ＨＩＦ－ｌａ发生相互作用逡逑１．２逦检测ＨＩＦ－１邋ａ与ＧＡ６的相互作用结构域确定逡逑通过构建带有ＧＳＴ标签的ＧＡ６的截断突变体ＧＳＴ－ＧＡ６邋（１－１００）邋．邋ＧＳＴ－ＧＡ６逡逑（１０１－２２０）邋，ＧＳＴ－ＧＡ６邋（２２１－３６１）邋，ＧＳＴ－ＧＡ６邋（３６２－５４１），ＧＳＴ－ＧＡ６邋（５４２－７３１），将带逡逑有Ｍｙｃ－ＨＩＦｌａ的真核表达载体与上述截短突变体在２９３Ｔ细胞系中共转染，收取细胞，逡逑鉴定转染成功后，以及小量诱导蛋白成功表达后，提取蛋白细胞裂解产物，利用半逡逑ｐｕｌｌｄｏｗｎ的实验方法，分析二者结合情况，其结果显７Ｋ邋ＨＩＦ－ｌａ与ＧＡ６相互作用结构逡逑域位于ＧＡ６的第５４２－７３１位氨基酸（图１．２）。逡逑ＩＰ邋：邋ＧＳＴ逡逑ＩＢ邋：邋Ｍｙｃ逦蝴＿？．逡逑ＭＷ（ｋＤａ）９0Ｂ逡逑５５－１逡逑图１．２半ｐｕｌｌｄｏｗｎ结果显示ＨＩＦ－ｌａ与ＧＡ６相互作用于ＧＡ６邋（５４２－７３１）逡逑１．３逦ＧＡ６在蛋白表达水平对ＨＩＦ１邋ａ有调控作用逡逑在上述实验中，我们己经确定了邋ＧＡ６与ＨＩＦｌ邋ａ有相互作用以及二者相互作用的逡逑结构域为ＧＡ６的第５４２－７３１位氨基酸，我们又分别通过在２９３Ｔ细胞系中转入表达载逡逑体Ｆｌａｇ－ＧＡ６，和敲低转染ｓｉＧＡ６后，对其表达的ＨＩＦ１邋ａ通过ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ进行检测，逡逑结果发现在２９３Ｔ细胞系中转入Ｆｌａｇ－ＧＡ６可以增加ＨＩＦ１邋ａ表达（图１．３邋Ａ）；敲低逡逑ＧＡ６可以降低ＨＩＦｌａ表达（图１．３Ｂ）。逡逑＜逦２９逡逑

【参考文献】