SALL4与乳腺癌生物学行为的相关性及影响乳腺癌阿霉素耐药性的机制研究

发布时间：2020-06-25 07:29

【摘要】：背景:乳腺癌是目前全世界女性最常见的恶性肿瘤之一。虽然当今乳腺癌的诊断及综合治疗策略包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗、免疫治疗等正日益突飞猛进,乳腺癌的临床疗效明显提高,然而乳腺癌的局部复发和远处转移仍频繁发生,导致部分乳腺癌患者预后较差。明确乳腺癌发生、发展、转移、侵袭、增殖、耐药等生物学特征的相关因素和作用机制,探索乳腺癌新的治疗靶点和治疗方法仍然迫在眉睫。婆罗双树样基因4(Sal-Like 4,SALL4)是近年发现的原癌基因,位于人类20号染色体20q13.13-q13.2区域,可以编码SALL4A、SALL4B和SALL4C三种异构体蛋白。SALL4在胚胎的早期发育、器官形成以及胚胎干细胞增殖、多能性维持和自我更新方面均发挥着重要的作用,且与遗传性疾病、白血病、淋巴瘤等疾病的发生发展存在相关性。越来越多的证据表明SALL4在多种肿瘤中高表达,如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、肾母细胞瘤、子宫内膜癌、和生殖细胞瘤等,并且在恶性肿瘤发生、发展中起重要作用。近年来,国内外文献对SALL4的结构、功能、生物学特征、与非肿瘤及肿瘤疾病发生发展的关系等已有多方面报道,其中较多的是研究SALL4与造血系统、先天性疾病、生殖细胞肿瘤等疾病的关系,对其与乳腺癌关系的研究仍然比较缺乏,SALL4在乳腺癌中扮演的角色尚未被阐明。本实验旨在研究SALL4与乳腺癌生物学行为的相关性及其影响乳腺癌阿霉素耐药性的机制。方法:1、通过RT-PCR、Western blot检测30对乳腺癌组织及其配对癌旁组织中SALL4的表达差异;选取75例患者的乳腺癌组织,通过免疫组织化学方法检测乳腺癌中SALL4表达水平与临床病理学参数之间的关系。2、构建沉默SALL4的乳腺癌细胞系,通过平板克隆形成实验、MTT法、CCK-8法和裸鼠体内成瘤实验检测SALL4对乳腺癌细胞增殖活性的影响;通过流式细胞仪及Western blot检测SALL4对乳腺癌细胞凋亡比例及凋亡相关蛋白表达的影响;通过流式细胞仪及Western blot检测SALL4对乳腺癌细胞周期及周期相关蛋白表达的影响;通过细胞划痕实验检测SALL4对乳腺癌细胞迁移能力的影响;通过Transwell小室实验检测SALL4对乳腺癌细胞侵袭能力的影响;通过MTT法检测SALL4对乳腺癌细胞阿霉素耐药性的影响。3、通过Western blot法检测沉默SALL4基因后MCF-7细胞中PTEN、Notch1、Wnt3a的表达量,筛选SALL4可能调节的耐药通路。构建沉默SALL4的shSALL4-MCF-7/ADR细胞株。阿霉素处理MCF-7,MCF-7/ADR,shSALL4-MCF-7/ADR后,MTT法检测SALL4对细胞增殖活性及IC50的影响,流式细胞仪检测SALL4对细胞凋亡情况及胞内阿霉素含量的影响;RT-PCR和Western blot检测SALL4对耐药基因ABCB1、ABCG2、c-myc表达的影响;RT-PCR和Western blot检测SALL4对PTEN表达的影响;Western blot检测SALL4对p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR表达的影响。在阿霉素处理的MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR两组细胞中,流式细胞仪检测加入PTEN抑制剂后SALL4影响细胞凋亡比例的变化;Western blot检测加入PTEN抑制剂后SALL4影响ABCB1、ABCG2、c-myc表达量的变化。结果:1、SALL4在乳腺癌组织中的表达量明显高于与其配对的癌旁组织。在临床病理资料统计中,SALL4高表达组淋巴结转移例数明显高于SALL4低表达组,而SALL4与年龄、病理类型、组织学分级、肿瘤大小、ER、PR、Her-2、Ki67表达水平无明显相关,其中SALL4阳性组肿瘤大小均值较阴性组有增加的趋势。2、在MDA-MB-435、MDA-MB-468、MCF-7细胞系中成功构建沉默SALL4的乳腺癌细胞系。沉默SALL4可以明显抑制乳腺癌细胞的增殖活性,抑制裸鼠体内肿瘤的生长;明显降低乳腺癌细胞S期细胞比例,增加G1期细胞比例,促进乳腺癌细胞停滞于G1期,阻滞细胞周期进展;沉默SALL4后乳腺癌细胞的凋亡比例明显增加,侵袭和迁移能力明显降低,对阿霉素的耐药性明显降低。3、成功构建沉默SALL4的乳腺癌耐药细胞系shSALL4-MCF-7/ADR,验证SALL4在MCF-7/ADR中的表达量明显高于MCF-7、shSALL4-MCF-7/ADR。在阿霉素处理的细胞中沉默SALL4,各组细胞的IC50降低,凋亡率显著上升,胞内阿霉素含量显著上升,ABCB1、ABCG2、c-myc表达量明显下降。沉默SALL4后各组细胞PTEN表达量明显上升,p-AKT、p-mTOR表达量明显下降。shSALL4-MCF-7/ADR细胞的凋亡比例较MCF-7/ADR细胞明显上升,耐药基因ABCB1、ABCG2、c-myc表达量明显下降;加入PTEN抑制剂后shSALL4-MCF-7/ADR细胞的凋亡比例无明显上升,ABCB1、ABCG2、c-myc表达量无明显下降。结论:SALL4在乳腺癌组织中的表达量较癌旁组织高,与淋巴结转移明显相关;沉默SALL4可以明显抑制乳腺癌细胞的增殖活性,增加乳腺癌细胞的凋亡,阻滞细胞周期进展,抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移,降低乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性;SALL4在MCF-7细胞中可以通过PTEN/AKT/mTOR通路影响乳腺癌细胞的阿霉素耐药性。本研究对深入了解乳腺癌发生发展的分子机制提供了新的理论依据,为乳腺癌的治疗提供可能的新的治疗靶点。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

图 1 SALL4 在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达。A：Western blot 验证 SALL4 的表达；B：RT-PCR 验证 SALL4 mRNA 的表达。3.2 SALL4 表达水平与临床病理特征的相关性免疫组织化学(SP)法检测 SALL4 在乳腺癌组织中的表达。图 2A 为 SALL4高表达的乳腺癌组织，图 2B 为 SALL4 低表达的乳腺癌组织，并按照免疫组织化学染色评分标准将其分为SALL4 高表达组(n=26)与SALL4 低表达组(n=49)(图2)。统计分析发现 SALL4 高表达组淋巴结转移例数明显高于 SALL4 低表达组，差异有统计学意义(p<0.05)；而与患者的年龄、病理类型、组织学分级、肿瘤大小、ER、PR、Her-2、Ki67 表达水平无明显相关(p>0.05)。其中 SALL4 阳性组肿瘤大小均值(4.337±3.385cm)较 SALL4 阴性组肿瘤大小均值(3.919±2.690cm)大，

鄡浞治sALL4 高表达组(n=26)与SALL4 低表达组(n=49)(图2)。统计分析发现 SALL4 高表达组淋巴结转移例数明显高于 SALL4 低表达组，差异有统计学意义(p<0.05)；而与患者的年龄、病理类型、组织学分级、肿瘤大小、ER、PR、Her-2、Ki67 表达水平无明显相关(p>0.05)。其中 SALL4 阳性组肿瘤大小均值(4.337±3.385cm)较 SALL4 阴性组肿瘤大小均值(3.919±2.690cm)大，

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本文编号：2729048