NEK9异常表达在乳腺癌发生发展中的作用机制研究

发布时间：2020-06-26 15:31

【摘要】：目的:乳腺癌是女性常见恶性肿瘤,近年来发病率呈上升趋势,现已居女性恶性肿瘤首位。目前乳腺癌的治疗以手术切除为主,但是目前肿瘤的局部扩散、淋巴结转移和远处转移仍然是制约乳腺癌预后的主要原因,尤其是三阴性乳腺癌缺乏特异的靶点,对内分泌治疗不敏感,治疗效果差,复发率、死亡率居高不下。乳腺癌严重危害女性的生命健康和生活质量,深入研究乳腺癌发生发展的分子机制,寻找新的治疗靶点,是有效提高乳腺癌患者生存率的重要方法。Nek家族又称为“第三蛋白激酶家族”,参与细胞周期关键点调控,促进中心粒成熟,调节染色体凝聚、纺锤体组装。人类Nek激酶家族包含11个成员(Nek1-Nek11),目前为止,Nek基因家族成员的大部分功能是未知的。近年来发现多个Nek家族成员在有丝分裂中参加G2-M检验点的调控。这其中又以Nek2与NIMA同源性最高,功能研究较为清楚。该基因参与调控中心体组装以及染色体分离。Nek9的研究仅限于对细胞周期的调控。我们课题组前期发现乳腺癌中存在Nek9等位基因的杂合缺失,我们在此基础上检测了 316例乳腺癌中NEK9的表达,发现在乳腺浸润性导管癌中,NEK9表达存在显著下调,甚至缺失,其表达与ER、PR表达呈正相关,与肿瘤大小、p53功能失常、HER-2扩增、高增殖指数、组织学级别呈负相关,提示NEK9低表达乳腺癌恶性程度高、生长快,Nek9或在乳腺癌的浸润、转移过程中发挥重要作用。目前Nek9在在乳腺癌中如何发挥抑癌作用的机制尚未明确,为了更好的了解Nek9在乳腺癌发生发展中的机制,为临床疾病诊断提供新的标记物及治疗靶点,我们继续探究Nek9在乳腺癌发生发展中的作用机制。方法:1.利用细胞免疫组织化学、RT-qPCR及Western blot(WB)技术在mRNA及蛋白水平检测乳腺癌细胞系中Nek9的基础表达,根据表达量及细胞状态选择Nek9低表达的MDA-MB-468及Nek9高表达的MCF-7细胞系。2.构建针对Nek9的过表达及沉默病毒,对选定的细胞系进行感染,利用抗生素筛选,建立稳定表达细胞株。选取MCF-7细胞系,Nek9沉默组作为实验组,空载病毒转染组作为对照,RT-qPCR、Western blot检测转染效率,达到60%以上后,收细胞沉渣加Trizol送公司进行表达谱芯片检测。3.利用免疫共沉淀结合蛋白质谱技术,检测与Nek9相互作用的蛋白。同时构建小鼠荷瘤模型进行体内实验,对Nek9抑制增及通路机制进行体内实验验证。4.表达谱芯片及蛋白质谱分析筛选出VEGF及PLK1细胞周期调控通路,利用RT-Qpcr、WB验证检测结果,并检测通路相关蛋白变化。5.对芯片结果进行GO富集、KEGG分析,选出差异明显的基因进行通路验证。利用双荧光素酶实验寻找Nek9上游启动子,免疫共沉淀验证相互作用蛋白。6.利用免疫组化方法检测CD34及VEGF表达,用以评估肿瘤血管生成情况。7.由于Nek9与细胞周期调控相关,选取MCF-7细胞,对细胞进行Nek9小干扰沉默处理,用诺考达唑将细胞阻滞在G2/M期,去除药物作用后,细胞生长一段时间,分别用α2和γ-tublin对纺锤体及中心粒染色,在共聚焦显微镜下观察Nek9沉默组及空白对照组中心粒、纺锤体的状态。结果:1.小鼠皮下成瘤实验,两组小鼠均成瘤,数量无明显差异,但Nek9过表达组肿瘤体积明显小于空白对照组肿瘤体积,且差异有统计学意义,在体内Nek9抑制肿瘤的增殖。小鼠尾静脉注射实验,Nek9过表达组肝脏、肺脏等器官转移较空白对照组少,进一步证实Nek9可以抑制肿瘤的侵袭转移。2.表达谱芯片显示Nek9沉默组VEGF通路基因存在较多改变,结合蛋白质谱结果显示Nek9与细胞周期调节相关。3.对VEGF通路关键蛋白进行验证,结果显示在Nek9沉默组,通路关键蛋白P38、HSP27、MAPK较空白组表达升高。表明,Nek9高达表可以抑制VEGF通路活性,从而起到抑制肿瘤血管生成的作用,抑制肿瘤增殖。对小鼠肿瘤组织进行免疫组织化学检测CD34的表达以评估血管密度,统计结果显示在Nek9过表达组CD34呈现高表达,这表明,在体内Nek9抑制肿瘤组织血管生成。4.结合免疫共沉淀及蛋白质谱结果分析,Nek6/7,、PLK、CDK1与Nek9存在相互作用,PLK激活磷酸化Nek9,进而磷酸化下游底物Nek6/7,共同发挥细胞周期调控作用。5.共聚焦显微镜下观察到,Nek9沉默后,中心粒纺锤体形成异常,染色体不能正常分离。结论:1.在体内Nek9抑制肿乳腺癌瘤细胞增殖,侵袭及转移。2.Nek9通过抑制VEGF表达,抑制乳腺癌肿瘤血管生成,从而抑制乳腺癌增殖、侵袭及浸润。3.Nek9被PLK1激活后,磷酸化Nek6/7,共同发挥细胞周期调控作用。4.Nek9缺失导致纺锤体组装异常,中心粒不能正常分离,导致染色质不能正常分离。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

细胞系,激素受体,中高,病毒

图１：各细胞系中Ｎｅｋ９基础表达量的检测。ＡＢＣ：ＮＥＫ９在激素受体阴性逡逑的细胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３】、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８弱阳性表达，在激素受体阳性细胞系逡逑ＭＣＦ－７中高表达；Ｄ：在ｍＲＮＡ水平检测Ｎｅｋ９在各细胞系表达，ＭＤＡ－ＭＢ－２３ＭＤＡ－ＭＢ－４６８低表达，ＭＣＦ－７中高表达；Ｅ：蛋白蛋白水平检测各细胞系ＮＥＫ９蛋白表达，ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８低表达，ＭＣＦ－７中高表达。逡逑２．建立稳定表达细胞株逡逑前期实验显示ＮＥＫ９在ＭＤＡ－ＭＢ－４６８呈低表达，在ＭＣＦ－７中呈较高水平逡逑表达，所以构建Ｎｅｋ９过表达病毒ＬＶ－ＧＦＰ－Ｎｅｋ９及沉默病毒ＬＶ－ＧＦＰ－ｓｉＮｅｋ９，逡逑分别对ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＣＦ－７进行过表达、沉默病毒感染，并检测感染效率。逡逑病毒载体进行了绿色荧光ＧＦＰ标记，预实验得出最佳转染条件，当ＭＯＩ值等逡逑于１００时，荧光显微镜下观察到荧光最多，表示此条件下病毒转染效率最高。逡逑转染４８ｈ后，细胞内开始表达绿色荧光，在荧光显微镜下观察，根据细胞荧

芯片,过表达,抑制细胞,通路分析

图４：基因芯片检测差异基因。Ａ：芯片结果显示，Ｎｅｋ９沉默后，有６０４个基逡逑因上调，７４３个基因下调；Ｂ：芯片数据ＧＯ富集分析Ｃ：基因芯片结果通路分析逡逑结果；Ｄ：筛选出的邋ＭＡＤ、ＳＭＡＤ９、ＩＴＧＢ２、ＡＲＥＧ、ＤＵＳＰ、ＳＥＬＰ邋差异基因，逡逑ｍＲＮＡ水平对芯片结果进行验证。逡逑４．体内、体外实验证实Ｎｅｋ９抑制细胞增值。逡逑体内实验证实Ｎｅｋ９抑制肿瘤细胞增值。前期实验已经证实Ｎｅｋ９在体外实逡逑验抑制细胞增值，为了更好的模拟体内真实环境，我们对Ｎｅｋ９的功能进行了逡逑体内验证。首先构建ＮＥＫ９过表达的病毒感染ＭＤＡ－ＭＢ－４６８，经过嘌呤霉素筛逡逑选，建立稳定表达的细胞株。分别将对照组和过表达组细胞扩增，保证其他条逡逑件相同情况下进行荷瘤小鼠模型构建，并每周观察记录小鼠肿瘤情况。基因表逡逑达谱芯片筛选出ＳＭＡＤ９变化较明显，我们推测Ｎｅｋ９通过ＴＧＦ－邋Ｐ通路发挥抑逡逑制细胞增值作用。逡逑

【参考文献】