【摘要】：研究背景:目前,肺癌的临床治疗效果,在肺癌机制研究以及临床药物开发不断发展的推动下取得了很大进步,但是肺癌病人的死亡率仍然位居首位,其5年生存率仍低于15%,这些主要是肺癌复发、耐药、以及远处转移所致。耐药常常是因为药物诱导凋亡失败导致,肺癌的远处转移在患者初诊时就已经发生,但因早、晚期肺癌的症状在临床上没有明显的差别,因此肺癌的转移过程不易被发现,这无疑地给临床治疗带来了巨大的挑战。因晚期肺癌患者错过了手术治疗的最佳时期,其治疗方案就只能以化疗、放疗为主。而常规化疗药物副作用大,而且容易发生耐药,因此研发出肿瘤细胞对其敏感,且同时具有抗肿瘤转移功效的药物具有重要价值。肿瘤细胞耐药因凋亡失败导致,为了提高药物的敏感性,改善肿瘤的治疗效果,寻找一种可代替细胞凋亡的细胞死亡形式,并采用对人体毒性低的强效抗肿瘤药将给癌症的治疗带来新的前景。自噬,不同于凋亡的另外一种程序性细胞死亡形式。近年来的研究表明,姜黄素对肿瘤细胞具有较强的杀伤效应,其中包括凋亡和自噬,且具有抑制肿瘤转移的生物学功能,姜黄素对凋亡的作用机制已经有大量报道,但其与肺癌细胞自噬间的相关性及作用机制并不完全清楚。为了有效地改善临床上肺癌的治疗效果、抑制肺癌转移,深入了解姜黄素抗肺癌转移的作用机制成为肿瘤研究领域的重要课题。上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),是指具有极性结构的上皮细胞丧失了紧密连接的结构的过程,在该过程中,上皮细胞转变成间质细胞形态特征、获得了间质细胞的分子标记物,且具有了更强的侵袭和迁移能力。EMT与肿瘤转移具有相同的特点,就是其调节因素多,机制相当复杂。在众多调节成分中,转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一个很重要的促EMT因子。因为EMT过程很短暂,因此很难直接在肺癌患者体内观察到EMT过程,通过已经确定的EMT的刺激因素作用于细胞或者动物来建立EMT模型,进行EMT机制的深入研究,也就成为国内外比较常用的研究方法。EMT过程的调节机制中,很多信号通路包括PI3K/AKT、Ras-MAPK、Hedgehog、rho、src以及wnt通路等通过协同、拮抗相互交叉对emt进行调节。其中wnt通路对emt的调节越来越受重视。wntinhibitoryfactor-1(wif-1)是wnt通路的关键拮抗因子之一、也是一重要的抑癌基因。有报道认为wif-1因启动子过度甲基化而导致表达下降,我们的前期研究也已证实wif-1在有些非小细胞肺癌细胞中表达呈下调或者不表达状态,但这与细胞类型有关,也即是并非在所有的肺癌细胞中wif-1都呈低表达状态。95d细胞、95c细胞中wif-1的表达情况需要用实验来明确。有报道认为wif-1表达的上调能够抑制骨肉瘤的转移。我们前期研究发现,双脱甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin,bdmc),也称为姜黄素-3,能使特定的非小细胞肺癌细胞中wif-1表达上调。木课题以人非小细胞肺癌细胞95d为主要研究对象,研究姜黄素-3对该细胞的的作用及其对emt的效应及机制。课题设想:根究国内外的研究及我们前期的发现,提出以下研究设想:姜黄素-3能够诱导肺癌细胞发生自噬。而且该自噬作用是有利于肿瘤细胞向死亡的方向发展。此外,因sonichedgehog通路与自噬有关,且姜黄素-3能够调控hedgehog通路,因此推测姜黄素-3通过调节sonichedgehog通路诱导自噬。另外,wif-1基因与肺癌的侵袭和迁移能力有关,姜黄素-3能够通过恢复wif-1的表达,抑制wnt通路。以此推断,姜黄素-3可能通过wif-1发挥对95d细胞emt过程的抑制,从而阻碍了肿瘤细胞的迁移和侵袭的生物学活性。本文的目的是阐明姜黄素-3在抗肿瘤转移中的作用及相关机制,为肺癌转移的治疗和预防提供理论依据,同时为肺癌的靶向治疗方案提供新思路。研究方法(1)利用cck8试验观察姜黄素-3对非小细胞肺癌细胞(包括a549细胞、高转移非小细胞肺癌细胞95d细胞)活性的作用情况;(2)利用荧光斑点实验、免疫印迹(westernbloting,wb)、电镜、流式细胞仪、基因干扰等方法检测姜黄素-3对a549、95d细胞自噬的作用并探索其作用机制,同时探讨自噬对凋亡和细胞活性的作用的影响;(3)利用tgf-β1作为诱发因素刺激95d细胞,建立emt模型;(4)利用细胞划痕实验、细胞侵袭实验来检测姜黄素-3对tgf-β1作用下95d细胞侵袭和迁移能力的影响;(5)利用免疫荧光、wb、逆转录聚合酶联反应(rt-pcr)检测姜黄素-3对tgf-β1诱导的95d细胞emt过程作用;(6)利用质粒转染建立稳定表达wif-1的95d细胞系,观察95d细胞侵袭和迁移能力的改变,以及emt分子标记物表达的变化;(7)利用基因干扰抑制基因表达方法来检测姜黄素-3对95d细胞自噬、emt的作用机制。实验结果(1)姜黄素-3可抑制95d细胞的生长活性,且其作用具有浓度和时间依赖性。但浓度值在10μmol/l以下的姜黄素-3对95d细胞的活性没有影响。(2)姜黄素-3能够诱导95d细胞自噬,该自噬作用能够降低细胞活性,促进细胞凋亡。(3)hedgehog通路的抑制能够诱导自噬的发生;(4)姜黄素-3能够抑制hedgehog信号通路,结合上一条结果可推断姜黄素-3诱发自噬的机制部分是通过抑制hedgehog通路实现的;(5)tgf-β1能够诱导95d细胞发生emt、tgf-β1能够促使wif-1的表达下降,且能激活wnt通路;(6)姜黄素-3能够抑制tgf-β1诱导的95d细胞的侵袭和迁移以及emt过程、说明姜黄素-3具有抗肿瘤转移的活性;(7)wif-1的过表达抑制了95d细胞的侵袭和迁移,及emt过程也受到了抑制。wif-1的表达能够抑制肿瘤的转移;(8)姜黄素-3能够恢复wif-1的表达,抑制wnt通路,说明姜黄素-3的抗瘤作用是通过上调wif-1癌基因的表达而实现;(9)利用rna干扰的办法阻断wif-1,发现对wif-1的抑制能够阻断姜黄素-3对95d细胞的emt过程的抑制作用,说明wif-1是姜黄素-3抗肿瘤转移的分子靶点;结论(1)姜黄素-3对正常的细胞没有毒性,而对肿瘤细胞的生长活性具有明显的抑制作用,且可诱导凋亡和自噬两种形式的细胞死亡。(2)姜黄素-3诱导自噬的机制是通过抑制hedgehog信号通路实现的。(3)姜黄素-3可以通过上调wif-1的表达来抑制肺癌细胞的emt,进而抑制其侵袭和迁移。说明姜黄素-3是一个多靶点的药物,在对抗肿瘤耐药和肿瘤转移治疗方面具有可观的前景。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
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本文编号：
2731202
