结直肠癌中差异表达circRNA的筛选及其功能研究

发布时间：2020-06-27 04:19

【摘要】：结直肠癌是世界上常见的消化道恶性肿瘤之一,严重危害人类生命健康。近年来,随着我国居民生活水平的提高,生活方式和饮食结构的改变,结直肠癌发病率呈逐年上升趋势,其发病率及死亡率均居常见恶性肿瘤前列。目前认为,改善结直肠癌患者预后的主要手段是提高其早期诊治率。但结直肠癌的早期诊治手段有限,对于晚期患者,治疗方案不多且效果欠佳,造成这一窘境的重要原因就是目前结直肠癌的发病机制尚未完全阐明。目前,基因调控学说、肿瘤干细胞学说和炎症学说是其发病机制的主要研究方向。基因调控学说已在多项研究中被证实,在结直肠癌的发生、发展中起着至关重要作用。基因的表达受多种因素的影响,近年来,随着生物信息学、基因测序等技术的发展,人们发现circRNA(circular RNA,circRNA)是一类新颖的可在哺乳动物体内能稳定表达、具有高度保守序列并能在转录或转录后水平对基因表达发挥重要调控作用的内源性非编码RNA。已有多项研究证实,circRNA的异常表达及调控与肿瘤的发生、发展相关,这其中包括肝癌、胃癌及结直肠癌等。CircRNA在人体内含量丰富、种类繁多,目前已被研究的circRNA只是极少数,仍有大量具有重要生物学功能的circRNA有待人们挖掘。因此,寻找在结直肠癌中存在差异表达并具有重要生物学功能的circRNA将为阐明结肠癌的发病机制奠定一定的基础,为结直肠癌的诊治提供新的靶点及思路。目的:筛选并鉴定1个参与结直肠癌进程调控的circRNA方法:1)从高通量测序数据库数据库(Sequence read archive,SRA)中下载已经公布的,12对结直肠癌及癌旁组织的RNA测序结果。首先,利用 FASTQ、TopHat2、Find_circ 软件,结合 UCSC(University of California Santa Cruz)数据库,按设置标准(FDR0.05,Fold change≥2),筛选出在结直肠癌及癌旁组织中差异表达的circRNA。然后通过Targetscan、miRanda、starbase预测差异表达circRNA的调控靶点,选出能够同时在三款预测软件中均取得良好预测结果的circRNA,构建他们的共调控网络。最后应用DAVID、Pathway Studio软件结合KEEG(Kyoto Encyclopedia Of Genes And Genomes)数据库对他们下游靶基因的潜在生物学功能进行分析。2)利用qRT-PCR检测上述circRNA在结直肠癌及癌旁组织中的表达水平,选出有显著差异表达的circRNA。随后分析他们的circRNA-miRNA-mRNA共表达调控网络节点,选定一个circRNA作为进一步研究对象。最后利用琼脂糖凝胶电泳及连接点测序验证该circRNA的成环性,通过RNaseR实验,验证其稳定性。3)收集40例结直肠癌患者手术标本(癌和癌旁)及相关临床病理资料,检测circHIPK3在癌及癌旁组织中的表达情况。结合患者临床资料,找出与circHIPK3表达水平相关的临床病理特征。4)培养HT29、SW480、LoVo、CAC02结直肠肿瘤细胞株及正常结肠上皮细胞株(FHC)。检测不同细胞株中circHIPK3的表达情况,选择合适细胞株进行进一步功能实验。构建过表达质粒,瞬时转染,利用qRT-PCR检测circHIPK3转染效率。通过CCK-8、平板克隆、凋亡、划痕及Transwell实验验证circHIPK3功能。最后结合第一部分的生物信息学分析及既往研究,推测circHIPK3的可能调控机制。利用qPCR检测circHIPK3与可能调控靶miRNA在结直肠癌组织中表达的相关性。结果:1)经FASTQ、TopHat2、Find_circ软件筛选,在RNA测序结果中共找到12个在结直肠癌及癌旁组织中存在差异表达circRNA,其中上调的为6个,下调的6个。能够同时在三个靶点预测软件中均取得良好预测结果的 circRNA 共 4 个(hsa_circ_0000284,hsa_circ_0000400,hsa_circ_0000523,hsa_circ_0087960)。GO 及 pathway 分析结果提示,该组circRNA所调控的蛋白主要参与到细胞周期调控、细胞增殖、细胞对药物的抵抗及组织重塑等生物学过程中,信号通路主要富集于Foxo及P53通路。2)上述 4 个 circRNA 的 qRT-PCR 检测结果提示,hsa_circ_0000400(circTUBA1B)及 hsa_circ_0000284(circHIPK3)在癌及癌旁组织中存在显著差异表达(p0.05)。分析circTUBA1B和circHIPK3的circRNA-miRNA-mRNA共表达调控网络,我们发现circHIPK3较circTUBA1B有更多的节点,其具有重要生物学功能的可能性更大,因此选择circHIPK3为进一步研究对象。琼脂糖凝胶电泳及连接点测序结果提示,circHIPK3能形成良好的环状结构。RNase R结果提示,在RNA分子中加入RNaseR后,circHIPK3仍有较高表达,而mHIPK3表达较对照组显著下降(p0.05),证实了 circHIPK3的稳定性。3)40对结直肠癌及癌旁组织qPCR结果提示,circHIPK3的在结直肠癌组织中的表达较癌旁显著下调,差异具有统计学意义(p0.05)。结合患者临床病理资料进行分析发现,circHIPK3的表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、浸润深度、分化程度无明显相关性,而与肿瘤转移显著相关(p0.05)。4)细胞实验结果显示,circHIPK3在结直肠癌细胞株中的表达水平较FHC细胞株降低,差异具有统计学意义(p0.05),我们选择了LoVo及SW480细胞株进行进一步功能实验。质粒瞬转后,qRT-PCR检测发现转染组circHIPK3表达水平较对照组显著升高。CCK-8、平板克隆、凋亡、划痕及Transwell实验结果证实,circHIPK3过表达组细胞株较对照组细胞增殖及迁移能力下降,凋亡比例增加。经分析发现,circHIPK3可能是通过circHIPK3-miR-20a-5p-P53轴来参与结直肠癌进程调控的。qPCR结果提示circHIPK3与miR-20a-5p的△CT在结直肠癌组织中呈负相关(r =-0.7378,p = 0.0149)。结论:(1)CircHIPK3在结直肠癌组织及细胞株中的表达下调,低的circHIPK3表达与患者肿瘤转移相关;(2)CircHIPK3抑制结直肠癌细胞生长和迁移;(3)CircHIPK3可能是一个负性结直肠癌进程调控因子。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34
【图文】：

差异表达,火山,预测软件,靶点

图１．１差异表达ｃｉｒｃＲＮＡ的火山图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１，１邋Ｖｏｌｃａｎｏ邋ｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｃｉｒｃＲＮＡ逡逑ＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共调控网络的构建逡逑用Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ、ｍｉＲａｎｄａ、Ｓｔａｒｂａｓｅ三款预测软件对上述差下游ｍｉＲＮＡ及最终调控的ｍＲＮＡ进行预测。同时在三个预测预测靶点的有邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００５２３邋（邋ｃｉｒｃＭＥＴＴＬ３邋），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ３），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００８７９６０邋（ｃｉｒｃＬＰＡＲｌ）及邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００４００邋（ｃｉｒｃＴ果，构建该组ｃｉｒｃＲＮＡ的ｃｉｒｃＲＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共调控网示，这些ｃｉｒｃＲＮＡ存在多个可能的ｍｉＲＮＡ结合位点，并可最终参与到基因表达的调控中。逡逑

预测软件,差异表达,靶点,结合位点

逦４逡逑Ｆｏｌｄ邋ｃｈａｎｇｅ逡逑图１．１差异表达ｃｉｒｃＲＮＡ的火山图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１，１邋Ｖｏｌｃａｎｏ邋ｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｃｉｒｃＲＮＡ逡逑３．３邋ＣｉｒｃＲＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共调控网络的构建逡逑同时应用Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ、ｍｉＲａｎｄａ、Ｓｔａｒｂａｓｅ三款预测软件对上述差异表达的逡逑ｃｉｒｃＲＮＡ的下游ｍｉＲＮＡ及最终调控的ｍＲＮＡ进行预测。同时在三个预测软件中均逡逑获得较好预测靶点的有邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００５２３邋（邋ｃｉｒｃＭＥＴＴＬ３邋），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００２８４逡逑（ｃｉｒｃＨＩＰＫ３），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００８７９６０邋（ｃｉｒｃＬＰＡＲｌ）及邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００４００邋（ｃｉｒｃＴＵＢＡｌＢ），逡逑根据预测结果，构建该组ｃｉｒｃＲＮＡ的ｃｉｒｃＲＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共调控网络，如下逡逑图。该图显示，这些ｃｉｒｃＲＮＡ存在多个可能的ｍｉＲＮＡ结合位点，并可能通过对他逡逑们的调节，最终参与到基因表达的调控中。逡逑２６逡逑

【参考文献】