Rap2b在肿瘤治疗中的应用及其分子机理初探

发布时间：2020-06-27 06:37

【摘要】：RAS相关蛋白家族成员Rap2b是一种新发现的p53下游靶基因。当p53+/+细胞受到外源性刺激时(如阿霉素给药),p53被激活,导致细胞内Rap2b蛋白的表达量显著增加,从而促进肿瘤细胞的生存。我们推测,Rap2b是一个有效的肿瘤治疗靶点。为此,本文设计了一种以纳米材料为载体的药物/基因递送系统,用于评估Rap2b siRNA作为一种抗肿瘤治疗药物的潜力。同时本文通过研究Rap2b与p53之间的相互作用,为阐明Rap2bsiRNA的抗肿瘤机制提供重要线索。首先,为了便于后续实验,我们制备了 Rap2b单克隆抗体。共得到八个单克隆抗体稳定细胞株。酶联免疫吸附实验结果显示八株均为IgG1类抗体。同时免疫印迹法结果显示抗体的最低使用浓度为0.1 μg/mL,所能检测到的蛋白最低量为5 ng。然后,我们通过氯金酸法合成了金纳米壳颗粒,并将合成的Rap2bsiRNA和阿霉素连接到金纳米壳上。纳米粒子与HCT116细胞共孵育后,在荧光显微镜下可见装载有阿霉素和Rap2b siRNA的金纳米壳被肿瘤细胞吸收。激光照射能显著促进金纳米壳释放阿霉素和Rap2b siRNA,而且释放的Rap2b siRNA能显著降低细胞内Rap2b的表达水平。接着,我们通过体外和体内实验评价了不同药物联用对肿瘤细胞的杀伤效应。结果显示,降低Rap2b的表达水平能显著增强阿霉素对于肿瘤细胞的杀伤效果。同时,激光照射纳米粒子产生的热能能对肿瘤细胞产生额外的杀伤作用,进一步提高了阿霉素的肿瘤治疗效果。最后,我们通过体外GST pulldown实验和体内双分子荧光互补实验证明了 Rap2b与p53之间存在直接相互作用。为了确定这两种蛋白互作的结构域,我们构建了一系列Rap2b和p53的截短突变体,再通过体外GSTpullldown实验和双分子荧光互补实验确定了 Rap2b的第41-135位氨基酸残基和p53的DNA结合结构域是二者直接相互作用的区域。综上所述,本研究证明了 Rap2b siRNA能显著增强阿霉素的抗肿瘤疗效,而且Rap2b能与p53直接结合,推测Rap2b可能通过与p53直接结合而负反馈调控p53的活性。这些发现有助于深入理解Rap2b和p53在肿瘤发生发展和耐药性形成中的作用,为抗肿瘤药物的研发提供了新靶点,对于恶性肿瘤的防治具有重要意义。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.5
【图文】：

示意图,信号通路,核心,示意图

后根据细胞类型和胁迫类型的不同，活化的ｐ５３可通过激活下游不同的靶基因进而诱导不逡逑同的生物学效应，例如细胞周期阻滞、ＤＮＡ修复、细胞凋亡以及抗血管生成和细胞衰老（见逡逑图１－１）等，从而表现出肿瘤抑制作用。近年来也有研究表明ｐ５３在干细胞分化过程中具逡逑有重要作用（Ｌｅｅ邋Ｋ．邋Ｈ．，ｅｆ邋ａ人，２０１０；邋Ｊｏｅｒｇｅｒ邋Ａ．邋Ｃ．邋ａｎｄ邋Ａ．邋Ｒ．邋Ｆｅｒｓｈｔ．，邋２００８；邋Ｚｈａｎｇ，邋Ｘ．，ｅｆ邋ａ／，逡逑２０１３）。因此，筛选并鉴定ｐ５３的祀基因，同时研宄这些靶基因的功能及其分子机制对于全逡逑面而深入的了解ｐ５３的功能，尤其是ｐ５３在肿瘠发生、发展中的作用以及寻找新的肿瘤治逡逑疗靶点等方面都具有非常重要的意义。逡逑

示意图,靶基因,示意图

逑在之前的研究中，研究者们利用基因芯片技术结合ＣＨ［Ｐ－ｃｈｉｐ技术在基因组水平筛选逡逑ｐ５３靶基因时，发现了一个具有促肿瘤细胞生存功能的新靶基因ＲａＰ２ｂ邋（见图１－２）邋（Ｚｈａｎｇ，逡逑Ｘ．，邋ｅｔ邋ａ／．，２０１３）0逡逑Ａ邋Ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｅｎｅ逦ｐ５３邋ｃｈｒｏｍａｔｉｎ邋ｂｉｎｄｉｎｇ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｃｈａｎｇｅ，邋ｐ＜０．００１逡逑ＭＥＦ逦ｍＥＳ逦ＭＥＦ逦ｍＥＳ逡逑＾＾３逦２９７０＾＾邋２４２逡逑ｂｉｎｄｉｎｇ逡逑Ｉ邋—邋Ａｌｏｘ５逡逑—Ｅｄａ２ｒ逡逑－Ｂｔｇ２逡逑－Ｍｄｍ２逡逑—Ａｄｒｂ２逡逑—Ｃｄｋｎｌａ逡逑－ＴｎｆｒｓｆｌＯｂ逡逑—Ｒａｐ２ｂ逡逑－Ｂｂｃ３逡逑图１－２．邋ｐ５３新靶基因Ｒａｐ２ｂ的筛选示意图（Ｚｈａｎｇ，邋Ｘ．，邋ｅＭ／．，邋２０１３）。逡逑Ｆｉｇ邋１－２．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｒａｐ２ｂ，邋ａ邋ｎｏｖｅｌ邋ｐ５３邋ｔａｒｇｅｔ邋ｇｅｎｅ．逡逑Ｒａｐ２ｂ基因共编码１８３个氨基酸。属于Ｒａｓ癌基因超家族，Ｒａｓ超家族小分子量ＧＴＰ逡逑结合蛋白的Ｒａｐ２亚家族（Ｔｏｒｔｉ，邋Ｍ．邋ａｎｄＬａｐｅｔｉｎａ，邋Ｅ．邋Ｇ．，邋１９９４）。Ｒａｐ２家族共包含三个成员：逡逑Ｒａｐ２ａ、Ｒａｐ２ｂ和Ｒａｐ２ｃ，三种蛋白序列具有高度同源性（见图１－４）。Ｒａｐ２ｂ蛋白在进化逡逑上局度保守

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