雄激素受体通过hsa-mir-18b调节肾细胞癌增殖的研究

发布时间：2020-06-28 04:03

【摘要】：目的:基因芯片检测研究发现,hsa-mir-18b在正常肾组织与癌组织之间表达存在差异。对于雄激素受体(androgen receptor,AR)在肾癌中的表达及对肾癌发生发展的作用也有待商榷。本项目利用临床肾癌组织标本及肾癌细胞系,检测hsa-mir-18b及AR的表达,探讨二者在肾癌增殖中的作用及关系,进一步明确两者在肾癌发生发展中的作用,为探索肾细胞癌新的可行的治疗方法及潜在的靶点提供实验理论依据。方法:选择肾小管上皮细胞系HKC,肾癌细胞系OSRC-2与ACHN,通过蛋白印迹实验(Western blot)检测细胞系中AR的表达,选择AR表达较高的OSRC-2细胞系,采用慢病毒感染进行AR敲低。构建四质粒系统慢病毒载体,将慢病毒首先转染于293T细胞,培养一定时间后收集病毒液。再将病毒液感染肾癌细胞系后继续培养一定时间,之后用嘌呤霉素进行筛选,来获得AR降表达的稳定细胞系。采用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞的增殖能力。根据miRwalk网站预测的AR下游的靶microRNA,且根据参考文献中基因芯片筛选出肾癌与肾组织中有差异表达的microRNA,选择hsa-mir-18b进行研究。探讨AR与hsa-mir-18b表达的关系,检测二者对肾癌细胞增殖的作用。收集肾透明细胞癌(clear cell carcinoma renal cell carcinoma,ccRCC)配对的癌组织及邻近正常组织30例。采用Western blot及Real-time PCR检测AR在肾癌及邻近正常组织中的表达。同时,用Real-time PCR检测hsa-mir-18b的表达,验证两者之间的关系。结果:1.应用Western blot检测OSRC-2、ACHN及HKC三个细胞系中的AR的蛋白表达水平,结果显示OSRC-2细胞系中的AR的表达量较高,HKC及ACHN细胞系中不表达AR;Real-time PCR检测AR的转录水平,结果与蛋白水平一致。2.慢病毒转染OSRC-2细胞系后,Western blot及Real-time PCR验证显示AR的蛋白质和转录水平均明显降低,细胞系构建成功。3.MTT实验方法检测显示OSRC-2-shAR细胞增殖能力较对照组相比明显降低(P0.01)。4.利用miRwalk网站预测AR可能参与调控的micro-RNA,7个数据库进行预测,其中5个数据库预测hsa-mir-18b可能为AR的靶microRNA。5.通过Real-time PCR检测OSRC-2和OSRC-2-shAR细胞系中hsa-mir-18b的表达量,发现敲低AR后hsa-mir-18b的表达量升高(P0.001)。6.MTT实验检测OSRC-2+hsa-mir-18b inhibitor、OSRC-2、OSRC-2-shAR+hsa-mir-18b inhibitor和OSRC-2-shAR四种细胞系中肾癌细胞增殖能力,结果显示AR通过调控hsa-mir-18b参与调节肾癌细胞的增殖。7.检测肾癌组织样本及邻近正常肾组织中hsa-mir-18b的表达量,发现hsa-mir-18b在肾癌组织中较低,而相应的邻近正常肾组织表达较高,其中26对(86.7%)hsa-mir-18b表达下调,4对(13.3%)表达上调(P0.01)。8.hsa-mir-18b的表达水平与肾癌TNM分期显著相关,但与患者的性别、年龄、肿瘤位置及大小、Furhman分级等因素无关。9.Western blot实验检测30对临床标本中AR的蛋白表达情况,发现AR在肾癌组织中的表达比相应的邻近正常肾组织明显降低(P0.01)。Real-time PCR方法测验30例配对组织中AR在mRNA水平的表达量,发现癌组织中AR的表达明显升高(P0.01)。结论:1.在肾癌组织中AR的蛋白与mRNA的表达水平不一致。2.肾癌组织中hsa-mir-18b的表达较邻近正常肾组织中降低。3.相关的功能研究显示肾癌细胞系中,AR降表达后肾癌细胞的增殖能力降低,hsa-mir-18b表达增高;抑制hsa-mir-18b表达,肾癌细胞增殖能力增强。4.AR通过调控hsa-mir-18b参与调节肾细胞癌的增殖。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.11
【图文】：

现结晶全部溶解；7)用酶标免疫检测仪在570nm处测吸光度，计算每个孔的值并求平均值，每天重复计数，连续3或6天。1.1.4 统计学处理采用 SPSS20.0 统计软件对本研究所有数据进行分析，应用配对 t 检验及卡方检验，其中 P<0.05 代表差异有统计学的意义。1.2 结果1.2.1 肾小管上皮细胞及肾癌细胞系 AR 的表达为了选择 AR 表达较高的肾细胞系，我们采用免疫印迹 Western blot 实验方法对肾小管上皮细胞 HKC 及肾癌 OSRC-2、ACHN 细胞系中 AR 的表达情况进行检测。结果显示 AR 在 OSRC-2 细胞系中表达较高，在人正常肾小管上皮细胞及 ACHN 细胞中不表达(图 1.1 A)。同时为了判断 AR 在转录水平的表达情况，我们通过 Real-time PCR 对以上三种细胞系进行检测，结果与蛋白表达水平一致(图 1.1 B)。

Western blot及Real-time PCR实验对敲低效果进行检验。其中，导入AR敲低质粒组与未处理的OSRC-2细胞系相比，AR的表达明显降低；导入空质粒scramble(scr)组与未处理的OSRC-2细胞系相比，AR的表达无明显差异(图1.2)。这提示AR降表达的稳定细胞系构建成功，能够用来进行下一步实验。图 1.2 慢病毒转染后 AR 敲低效果左图为利用 Western blot 检测 AR 在细胞系中蛋白水平的表达，以 GAPDH当作内参；OSRC-2 表示未经处理的肾癌细胞，OSRC-2-scr 表示转入无序质粒的肾癌细胞，sh-AR 表示转入 AR 降表达质粒的肾癌细胞。右图为利用 Real-timePCR 方法检测转染后细胞系中 AR 的 mRNA 表达水平，以 GAPDH 作为内参，**代表 P<0.01。1.2.3 AR 降表达后细胞增殖能力降低通过体外 MTT 细胞增殖实验的方法检测 AR 对肾癌细胞增殖的影响。其中，未处理的 OSRC-2 实验组与转入空质粒的对照组对比

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本文编号：2732530